Естественный продукт обнаружение с LC-MS/MS диагностическая фрагментация фильтрации: применение для анализа Микроцистин
Summary
Фильтрация по диагностическим фрагментация, внедрен в МНА, представляет собой элегантный подход после приобретения для проверки наборов данных LC-MS/MS для целых классов как известных, так и неизвестных натуральных продуктов. Этот инструмент ищет MS/MS спектры для ионов продуктов и/или нейтральных потерь, которые аналитик определил как диагностические для всего класса соединений.
Abstract
Натуральные продукты часто биосинтиразмерные как смеси структурно аналогичных соединений, а не одного соединения. Из-за их общих структурных особенностей, многие соединения в пределах одного класса проходят аналогичную фрагментация MS/MS и имеют несколько идентичных ионов продукта и/или нейтральных потерь. Целью диагностической фильтрации фрагментации (ДФФ) является эффективное обнаружение всех соединений данного класса в сложном экстракте путем скрининга нецелевых наборов данных LC-MS/MS для спектров MS/MS, содержащих специфические ионы продукта и/или нейтральные потери. Этот метод основан на модуле ДФФ, реализуем в рамках платформы с открытым исходным кодом ммпо, которая требует, чтобы образцы проб анализировались с помощью приобретения, зависимого от данных, от масс-спектрометра высокого разрешения, таких как четырехполюсный Орбитрапа или четырехполюсный период времени полета Анализаторы. Основным ограничением этого подхода является аналитик должен сначала определить, какие ионы продукта и/или нейтральных потерь являются специфическими для целевого класса натуральных продуктов. ДФФ допускает последующее обнаружение всех сопутствующих натуральных продуктов в рамках сложного образца, включая новые соединения. В этой работе мы демонстрируем эффективность ДФФ путем скрининга экстрактов aeruginosa, видного вредного цветения водорослей, вызывающего цианобактерии, для производства микроцистинов.
Introduction
Тандем масс-спектрометрия (МС/МС) является широко используемым методом масс-спектрометрии, который включает изолирование ионного прекурсора и индуцирование фрагментации через применение энергии активации, например, индуцированной столкновением ДИССОЦИАЦИИ (СИД)1. Манера, в которой фрагменты ионов тесно связана с его молекулярной структурой. Натуральные продукты часто биосинтиразмерные как смеси структурно аналогичных соединений, а не как единое уникальное химическое вещество2. Таким образом, структурно связанные соединения, которые являются частью одного и того же биосинетического класса, часто разделяют основные характеристики фрагментации MS/MS, включая общие ионы продукта и/или нейтральные потери. Способность экрана сложных образцов для соединений, которые обладают класса конкретных ионов продукта и/или нейтральных потерь является мощной стратегией для выявления целых классов соединений, что потенциально приводит к открытию новых натуральных продуктов3, 4 , 5 , 6. на протяжении десятилетий массовые спектрометрии, такие как сканирование нейтральных потерь и сканирование ионов-прекурсоров на аппаратурах с низким разрешением, позволили обнаружить ионы с одинаковой нейтральной потерей или ионами продукта. Однако, специфические ионы или переходы необходимо определить до выполнять эксперименты. Как масс-спектрометры с высоким разрешением стали более популярными в исследовательских лабораториях, сложные образцы теперь обычно проверяются с использованием нецелевых, зависимых от данных методов приобретения (ДВР). В отличие от традиционных нейтральных потерь и сканирования ионов-прекурсоров, структурно связанные соединения могут быть идентифицированы по послеприобретному анализу7. В этой работе, мы демонстрируем стратегию, которую мы разработали называется диагностическая фрагментация фильтрации (ДФФ)5,6, прямой и удобный подход, чтобы обнаружить целые классы соединений в сложных матриц. Этот модуль ДФФ был реализован на платформе с открытым исходным кодом, Мммин 2 и доступен, загрузив 2,38 мин или новых релизов. ДФФ позволяет пользователям эффективно экран DDA наборы для MS/MS спектры, которые содержат продукт Ион (ы) и/или нейтральных потерь (ES), которые являются диагностическими для целых классов соединений. Ограничением ДФФ являются характерные ионы продукта и/или нейтральные потери для класса соединений, которые должны определяться аналитиком.
Например, каждый из более чем 60 различных микотоксина идентифицировали8,9 обладают трикарбаллиевой боковой цепью, которая генерирует m/z 157,0142 (C6H5O5–) продукт Ион на Фрагментация [M-H]– Ion4. Таким образом, все предполагаемые фумонилины в образце могут быть обнаружены с помощью ДФФ путем скрининга всех спектров MS/MS в наборе данных ДВР, которые содержат видный m/z 157,0142 продукт Ион. Аналогичным образом, Сульфированный соединений могут быть обнаружены путем скрининга наборов данных ДВР для MS/MS спектры, которые содержат диагностические нейтральной потери 79,9574 Da (SO3)3. Этот подход также был успешно применен для обнаружения новых циклических пептидов5 и натуральных продуктов, содержащих триптофан или фенилаланин остатков6.
Для того чтобы продемонстрировать эффективность ДФФ и его простоту использования в рамках платформы Ммммин10, мы применили этот подход к анализу микроцистинов (МС); класс из более чем 240 структурно связанных токсинов, производимых пресноводной цианобактерий11,12,13.
Наиболее часто сообщаемых цианотоксинов являются МС, с MC-LR (лейцин [L]/аргинин [R]) конгенер чаще всего изучал (рис. 1). МС-Моноцикл, не-рибосомальных гептапептиды, биосинтроразмерный многочисленными цианобактерий, включая Микроциды, Анабаена, Nostoc, и Планктотрикс12,13. МС состоят из пяти распространенных остатков и двух переменных позиций, занимаемых L-аминокислотами. Почти все МС обладают характерной b-аминокислотой 3-амино-9-метокси-2, 6, 8-триметил-10-фенилдека-4, 6-диеновая кислота (Адда) остаток в положении 511. МС/МС фрагментация пути МС хорошо описаны14,15; остаток Adda ответственн для видно MS/MS продукт Ион, m/z 135,0803+ (C9H11O+) также, как другие ионы продукта включая m/z 163,1114+ (C11H15 O+) (рис. 2). Нецелевые наборы данных ДВР aeruginosa клеточных экстрактов могут быть проверены на все микроцистины, присутствующие с помощью этих диагностических ионов, предоставляемые микроцистины имеют остаток Adda.
Protocol
Representative Results
Discussion
ДФФ является прямым и быстрая стратегия для обнаружения целых классов соединений, особенно актуально для природного продукта соединения открытия. Наиболее важным аспектом ДФФ является определение конкретных критериев фрагментации МС/МС для целевого класса соединений. В этом репрезе…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Хизер Рошон (Канадский центр Фитологических культур, Университет Ватерлоо за предоставление изучаемых цианобактерий и Сасан Абушарх (Карлтонский университет) за техническую помощь.
Materials
| Cyanobacteria | |||
| Microcystis aeruginosaCPCC300 | CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE | CPCC300 | https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/ |
| Software | |||
| Proteowizard (software) | software | http://proteowizard.sourceforge.net/ | |
| Mzmine 2 | software | http://mzmine.github.io/ | |
| LC-MS | |||
| Q-Exactive Orbitrap | Thermo | – | Equipped with HESI ionization source |
| 1290 UHPLC | Agilent | Equipped with binary pump, autosampler, column compartment | |
| C18 column | Agilent | 959757-902 | Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 × 100 mm, 1.8 μm) |
| Solvents | |||
| Optima LC-MS grade Methanol | Fisher | A456-4 | |
| OptimaLC-MS grade Acetonitrile | Fisher | A955-4 | |
| OptimaLC-MS grade Water | Fisher | W6-4 | |
| LC-MS grade Formic Acid | Fisher | A11710X1-AMP | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Centrifuge Sorvall Micro 21 | Thermo Scientific | 75-772-436 | |
| Other | |||
| Amber HPLC vials 2 mL/caps | Agilent | 5182-0716/5182-0717 | |
| 0.2-μm PTFE syringe filters | Pall Corp. | 4521 | |
| Whatman 47mm GF/A glass microfiber filters | Sigma-Aldrich | WHA1820047 | |
| Media | |||
| MA media (pH 8.6) ( quantity / L) | Watanabe, M. F. & Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985). | ||
| Ca(NO3)·4H2O, 50 mg | Sigma-Aldrich | C2786 | |
| KNO3, 100 mg | Sigma-Aldrich | P8291 | |
| NaNO3, 50 mg | Sigma-Aldrich | S5022 | |
| Na2SO4, 40 mg | Sigma-Aldrich | S5640 | |
| MgCl2·6H20, 50 mg | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium glycerophosphate, 100 mg | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| H3BO3, 20 mg | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Bicine, 500 mg | Sigma-Aldrich | RES1151B-B7 | |
| P(IV) metal solution, 5 mL | |||
| Bring the following to 1 L with ddH2O | |||
| NaEDTA·2HO | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| FeCl3 ·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| MnCl2·4H2O | Baker | 2540 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Na2MoO4·2H2O | Baker | 3764 | |
| Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater Solution | Sigma-Aldrich | C3061-500mL |
References
- Mayer, P. M., Poon, C. The mechanisms of collisional activation of ions in mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28 (4), 608-639 (2009).
- Fisch, K. M. Biosynthesis of natural products by microbial iterative hybrid PKS–NRPS. RSC Advances. 3 (40), 18228-18247 (2013).
- Kelman, M. J., et al. Identification of six new Alternaria sulfoconjugated metabolites by high-resolution neutral loss filtering. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (19), 1805-1810 (2015).
- Renaud, J. B., Kelman, M. J., Qi, T. F., Seifert, K. A., Sumarah, M. W. Product ion filtering with rapid polarity switching for the detection of all fumonisins and AAL-toxins. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (22), 2131-2139 (2015).
- Renaud, J. B., Kelman, M. J., McMullin, D. R., Yeung, K. K. -. C., Sumarah, M. W. Application of C8 liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of enniatins and bassianolides. Journal of Chromatography A. 1508, 65-72 (2017).
- Walsh, J. P., et al. Diagnostic Fragmentation Filtering for the Discovery of New Chaetoglobosins and Cytochalasins. Rapid Communications in Mass Spectrometry. , (2018).
- Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature biotechnology. 34 (8), 828 (2016).
- Bartók, T., Szécsi, &. #. 1. 9. 3. ;., Szekeres, A., Mesterházy, &. #. 1. 9. 3. ;., Bartók, M. Detection of new fumonisin mycotoxins and fumonisin-like compounds by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization ion trap mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry: An International Journal Devoted to the Rapid Dissemination of Up-to-the-Minute Research in Mass Spectrometry. 20 (16), 2447-2462 (2006).
- Bartók, T., et al. Detection and characterization of twenty-eight isomers of fumonisin B1 (FB1) mycotoxin in a solid rice culture infected with Fusarium verticillioides by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight and ion trap mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (1), 35-42 (2010).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Orešič, M. MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).
- Spoof, L., Catherine, A. Appendix 3: tables of microcystins and nodularins. Handbook of cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis. , 526-537 (2016).
- Pick, F. R. Blooming algae: a Canadian perspective on the rise of toxic cyanobacteria. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (7), 1149-1158 (2016).
- Carmichael, W. W., Boyer, G. L. Health impacts from cyanobacteria harmful algae blooms: Implications for the North American Great Lakes. Harmful algae. 54, 194-212 (2016).
- Mayumi, T., et al. Structural characterization of microcystins by LC/MS/MS under ion trap conditions. The Journal of antibiotics. 59 (11), 710 (2006).
- Frias, H. V., et al. Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event. Biochemical and biophysical research communications. 344 (3), 741-746 (2006).
- Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).
- Watanabe, M. F., Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).
- Hollingdale, C., et al. Feasibility study on production of a matrix reference material for cyanobacterial toxins. Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (18), 5353-5363 (2015).
- Yuan, M., Namikoshi, M., Otsuki, A., Sivonen, K. Effect of amino acid side-chain on fragmentation of cyclic peptide ions: differences of electrospray ionization/collision-induced decomposition mass spectra of toxic heptapeptide microcystins containing ADMAdda instead of Adda. European Mass Spectrometry. 4 (4), 287-298 (1998).
- Schymanski, E., et al. Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence. Environmental science & technology. 48 (4), 2097 (2014).
