Découverte de produits naturels avec filtrage de fragmentation diagnostique LC-MS/MS: application pour l’analyse microcystine

La spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) est une méthode de spectrométrie de masse largement utilisée qui consiste à isoler union précurseur et à induire la fragmentation par l’application d’énergie d’activation telle que la dissociation induite par collision (CID)¹. La manière dont un fragment d’ion est intimement lié à sa structure moléculaire. Les produits naturels sont souvent biosynthétisés comme des mélanges de composés structurellement similaires plutôt que comme un seul produit chimique unique². En tant que tels, les composés structurellement apparentés qui font partie de la même classe biosynthétique partagent souvent les principales caractéristiques de fragmentation des MS/MS, y compris les ions de produit partagés et/ou les pertes neutres. La capacité à échantillonne des échantillons complexes pour des composés qui possèdent des ions de produit spécifiques à la classe et/ou des pertes neutres est une stratégie puissante pour détecter des classes entières de composés, conduisant potentiellement à la découverte de nouveaux produits naturels^3, le ^{4 , 5} la plupart des ^{, 6}. pendant des décennies, des méthodes de spectrométrie de masse telles que la numérisation des pertes neutres et l’analyse des ions précurseurs effectuées sur des instruments à faible résolution ont permis de détecter les ions ayant les mêmes ions de perte ou de produit neutre. Cependant, les ions ou les transitions spécifiques devaient être définis avant d’effectuer les expériences. Comme les spectromètres de masse à haute résolution sont devenus plus populaires dans les laboratoires de recherche, les échantillons complexes sont maintenant couramment examinés en utilisant des méthodes d’acquisition non ciblées, dépendantes des données (DDA). Contrairement à la perte neutre traditionnelle et à la numérisation des ions précurseurs, les composés structurellement apparentés peuvent être identifiés par l’analyse post-acquisition⁷. Dans ce travail, nous démontrons une stratégie que nous avons développée appelée filtrage de fragmentation diagnostique (DFF)^5,6, une approche simple et conviviale pour détecter des classes entières de composés dans des matrices complexes. Ce module DFF a été mis en œuvre dans la plate-forme open-source, MZmine 2 et disponible en téléchargeant MZmine 2,38 ou des versions plus récentes. DFF permet aux utilisateurs d’écran efficacement les jeux de données DDA pour les spectres MS/MS qui contiennent des ions de produit (s) et/ou des pertes neutres qui sont diagnostiques pour des classes entières de composés. Une limitation de DFF est des ions produits caractéristiques et/ou des pertes neutres pour une classe de composés doivent être définies par l’analyste.

Par exemple, chacune des plus de 60 différentes mycotoxines fumonisines identifiées^8,9 possèdent une chaîne latérale tricarballylic, qui génère union de produit m/z 157,0142 (C₆H₅O₅^–) sur fragmentation du [M-H]^– ion⁴. Par conséquent, toutes les fumonisines putatives d’un échantillon peuvent être détectées à l’aide de DFF en criblant tous les spectres MS/MS dans un jeu de données DDA contenant l’ion de produit m/z 157,0142 en évidence. De même, les composés sulfatés peuvent être détectés en criblage de jeux de données DDA pour les spectres MS/MS qui contiennent une perte diagnostique neutre de 79,9574 da (SO₃)³. Cette approche a également été appliquée avec succès pour la détection de nouveaux peptides cycliques⁵ et des produits naturels qui contiennent des résidus de tryptophane ou de phénylalanine⁶.

Pour démontrer l’efficacité de la DFF et sa facilité d’utilisation au sein de la plate-forme MZmine¹⁰, nous avons appliqué cette approche à l’analyse des microcystines (MCS); une classe de plus de 240 toxines structurellement apparentées produites par les cyanobactéries d’eau douce^11,12,13.

Les cyanotoxines les plus couramment signalées sont des MCs, avec le congénère MC-LR (leucine [L]/arginine [R]) le plus fréquemment étudié (figure 1). Les MCs sont des heptapeptides monocycliques non ribosomiques, biosynthétisés par plusieurs genres de cyanobactéries, dont Microcystis, Anabaena, Nostoc et Planktothrix^12,13. Les MCs sont composés de cinq résidus communs et de deux positions variables occupées par les acides aminés L. Presque tous les MCs possèdent un résidu caractéristique de l’acide β-amino-3-amino-9-méthoxy-2, 6, 8-triméthyl-10-phényldéca-4, 6-diénoïque (Adda) à la position 5¹¹.  Les voies de fragmentation MS/MS des MCS sont bien décrites^14,15; le résidu Adda est responsable de l’ion de produit MS/MS, m/z 135,0803⁺ (c₉h₁₁O⁺), ainsi que d’autres ions produits, y compris m/z 163,1114⁺ (c₁₁h₁₅ O⁺) (figure 2). Les ensembles de données DDA non ciblés des extraits cellulaires de Microcystis aeruginosa peuvent être examinés pour toutes les microcystines présentes à l’aide de ces ions diagnostiques, étant donné que les microcystines ont un résidu Adda.