Kontinuierliche Blutentnahme in der Kleintier-Positronen-Emissionstomographie/Computertomographie ermöglicht die Messung der arteriellen Eingabefunktion

Alle Tierbehandlungen und -experimente wurden vom Landestierforschungsausschuss Mecklenburg-Vorpommern genehmigt (LALLF M-V/7221.3-1.1-004/18, Zulassung: 03.04.2018). Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt. HINWEIS: Die Tiere wurden unter Standardbedingungen (22 x 2 °C, 12 h Tag-Und-Nacht-Zyklus) mit Wasser und Nahrung ad libitum gehalten. Alle benötigten Geräte für die Vorbereitung des Shunt-Systems, das Betriebsverfahren und die tatsächlichen Messungen sind in der Tabelle der Materialienaufgeführt. 1. Vorbereitung und chirurgischer Eingriff zur Katheterisierung des Tieres Fasten Sie das Tier für mindestens 12 h mit freiem Zugang zu Wasser. Zur Anästhesie die Ratte in eine Induktionskammer geben und kontinuierlich mit Sauerstoff/Isofluran-Mischung füllen. Für die Initiierung verwenden 2,5-3,5% Isofluran und für die Wartung 1,5-3,0% (Durchflussrate von 1,2-1,5 L/min).HINWEIS: Fasten ist notwendig für Studien mit dem Tracer [18F]FDG, aber nicht für andere Tracer. Die Messung des Glukoseblutspiegels mit manuellen Blutentnahmen, die in Abschnitt 4 beschrieben sind, wird empfohlen, um stabile Werte zu gewährleisten oder bei der kinetischen Modellierung zu korrigieren. Legen Sie die anästhesierte Ratte in dorsaler Position auf eine Heizmatte, unter dem chirurgischen Mikroskop und fügen Sie die Vetsalbe auf ihren Augen hinzu. Überwachen und halten Sie die Körpertemperatur der Ratte während des Experiments kontinuierlich (37 x 0,5 °C) mit einer rektalen Sonde. Verkleben Sie die Beine der Ratte an der Arbeitsfläche, um die Beine in Position zu halten. Desinfizieren Sie die Einsatzstelle mit einem Schleimhautdesinfektionsmittel und rasieren Sie das Bein und den Schritt (Operationsseite) der Ratte. Mit einer endilösen Reinigung mit dem Desinfektionsmittel beenden. Machen Sie einen Schnitt von etwa 20 mm mit chirurgischen Zangen und Schere an der Leistengegend der Ratte. Sezieren Sie die feinen Hautschichten und setzen Sie die Oberschenkelvene, Arterie und Nerven mit der Mikrozange aus. Legen Sie zwei feine Filamente unter jede Oberschenkelvene und Arterie. Vene und Arterie mit jedem distalen Filament versiegeln und mit einer Bulldoggeklemme unter Spannung halten.Verwenden Sie die proximalen Nahtfilamente, um das Gefäß mit den Bulldoggenklemmen (ohne Knoten) zu spannen. Blockieren Sie die Vene mit einer Aneurysmenklemme proximal, aber 2-3 mm distal aus der Naht mit der Bulldogge Klemme. Verwenden Sie Hornhautscheren, um einen kleinen Schnitt in die Vene (1/3 des Durchmessers) zu machen und austretendes Blut mit einem sterilen Baumwolltausch zu entfernen. Die Vene mit einer dumpfen Zange dedukulieren und offen halten. Setzen Sie den geschärften Katheter (Innendurchmesser [ID]: 0,58 mm, Außendurchmesser [OD]: 0,96 mm) in die Vene ein und schieben Sie ihn in proximale Richtung bis zum Aneurysmusclip. Öffnen Sie den Aneurysmclip und schieben Sie den Katheter weiter in proximale Richtung (ca. 2-3 cm), wenn der Katheter richtig platziert ist, fließt Blut in den Katheter. Sichern Sie den Katheter mit der proximalen Naht, indem Sie zwei Knoten machen; Legen Sie bei Bedarf eine zusätzliche Naht um die Vene und den Katheter. Überprüfen Sie die Funktionalität des Katheters durch Spülen und Ansaugen mit einer Insulinspritze (30 G Nadel), gefüllt mit 100 l heparinisierter Salinelösung (50 Einheiten/ml). Legen Sie den Katheter in die Arterie, indem Sie die Schritte 1.6 und 1.7 wiederholen. Wenn beide Katheter richtig platziert sind, schließen Sie das Bein mit Nähten und tragen Sie das Tier zum PET/CT.HINWEIS: Seien Sie beim Transport des Tieres so vorsichtig wie möglich mit den Kathetern, da sonst eine Verschiebung des Katheters auftreten kann. 2. Einrichtung des Shunt-Systems Abbildung 2 : Schema der Messeinrichtung. (A) Schematische Zeichnung der Messeinstellungen. (B) Foto des angeschlossenen Shunt-Systems mit dem Twilit-Detektor, peristaltischer Pumpe und verschiedenen Steckertypen. Der Zeitverlauf der Radioaktivität im Blut einer Ratte wird erkannt, während das Tier (1) im PET/CT (2) gescannt wird. Daher wird der arterielle (a) und venöse (b) Katheter über Adapterteile (Stecker orange, Steckerblau und Steckergrün) mit dem Detektorpumpensystem verbunden. Das arterielle Blut wird dann vom arteriellen Katheter durch den Detektor (3) zu einer peristaltischen Pumpe (4) und über den Venenkatheter zurück in den Körper gepumpt. Ein 3-Wege-Ventil (7) ist in das Rohrsystem integriert, um Tracer-Injektion, manuelle sedern und Spülen durchzuführen. Ein T-Stück (8) wird zusammengesetzt, um Aktivität zu injizieren. Der Detektor ist mit einem Computer verbunden, um die kontinuierlichen Blutdaten anzuzeigen, zu kalibrieren und zu korrigieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 6 Teile der Feinbohrung Polythenrohre (FBPT) (ID: 0,58 mm, OD: 0,96 mm) mit einer Länge von c = 735 mm abschneiden; e = 100 mm; f = 171 mm, g = 875 mm; h = 90 mm und i = 75 mm (Abbildung 2). 8 Teile der Silikonpumpenrohre (schwarz/schwarz/schwarz, ID: 0,76 mm, OD: 2,48 mm) mit einer Länge von ca. 20 mm abschneiden. Stellen Sie Dieskondensidierverbinder (von ID 2,5 mm bis ID 1,5 mm) an beiden Enden des Silikonpumpenrohrs d (gelb/blau/gelb, ID: 1,52 mm, OD: 3,20 mm) auf. Legen Sie einen präparierten 20 mm Teil der Silikonrohre (schwarz/schwarz/schwarz) am anderen Ende der verwendeten Reduktionsverbinder an (siehe Stecker blau in Abbildung 2). Legen Sie das vorbereitete Teil c des FBPT in den montierten Steckverbinder blau auf das eine Ende des Silikonpumpenrohrs d (gelb/blau/gelb) und das vorbereitete Teil e des FBPT in den montierten anderen Ende. Legen Sie einen präparierten 20 mm Teil der Silikonrohre (schwarz/schwarz/schwarz) an die Enden von zwei T-Stücken 5 und 6 (Rohr T-Stecker ID: 1,5 mm; siehe Stecker grün in Abbildung 2). Schließen Sie das freie Ende des Teils e des FBPT an die linke Seite des montierten Steckers grün (5) an und platzieren Sie das vorbereitete Teil f des FBPT an der gegenüberliegenden Seite des Steckers grün (5). Legen Sie das freie Ende des Teils f des FBPT in die linke Seite des montierten Steckers grün (6) und legen Sie das vorbereitete Teil g des FBPT an der gegenüberliegenden Seite des Steckers grün (6). Fügen Sie das vorbereitete Teil h des FBPT an das freie Ende des montierten Steckverbinders grün (5) und das vorbereitete Teil i des FBPT an das freie Ende des montierten Steckers grün (6) an. Schließen Sie einen Kombistopper an eine hypodermische Nadel (G 23 x 1 1’4’/x 0,60 mm x 30 mm) an und fügen Sie ihn einem Dreiwegeventil hinzu. Legen Sie das vorbereitete Dreiwegeventil mit der Nadel in das freie Ende des Teils h des FBPT. Schließen Sie einen Kombistopper an eine hypodermische Nadel an und legen Sie die Nadel in das freie Ende des Teils i des FBPT.HINWEIS: Vor Beginn der Online-Blutentnahme siehe Abschnitt 5. Setzen Sie die freien Enden von Teil c und g des FBPT in einen 100 ml Becher gefüllt mit 20 ml heparinisierter Salinelösung (50 Einheiten/ml). Starten Sie die peristaltische Pumpe mit einer Durchflussrate von 1,52 ml/min, so dass das Shunt-System vollständig mit der physiologischen Salzlösung gefüllt ist. Danach drei Scherenklemmen an den Enden von Teil c und g und in der Mitte von Teil i des FBPT setzen. Lösen Sie die Scherenklemmen aus Teil c und g des FBPT. Schließen Sie den arteriellen Katheter a an das freie Ende von Teil c des FBPT an und verbinden Sie den Venenkatheter b mit dem freien Ende des Teils g des FBPT (siehe Stecker orange in Abbildung 2). 3. Bildaufnahme und -rekonstruktion Legen Sie das Tier in kopfgefährdeter Position auf die Shuttle-Bettpalette (70 mm). Steuern Sie die Atmung der Ratte und halten Sie die Körpertemperatur bei 37 °C bei 0,5 °C mit einem Heizkissen und einer rektalen Sonde während der gesamten Bildaufnahme. Bewegen Sie das Shuttlebett zur Injektion in die verlängerte Bettposition (Vorerfassung) und verbinden Sie die eingelegten Katheter mit dem Shunt-System. Halten Sie das Tier unter Anästhesie mit Isofluran (2,5% Isofluran in Sauerstoff, Durchflussrate 1,2-1,5 l/min) über einen Nasenkegel. Starten Sie die peristaltische Pumpe mit einer Durchflussrate von 1,52 ml/min, um das Shunt-System mit dem Blut des Tieres zu füllen. Bewegen Sie das Shuttlebett in die Mitte des Sichtfeldes des PET-Erkennungsrings und starten Sie das Online-Blutentnahmesystem (siehe Abschnitt 5). Starten Sie den PET/CT-Workflow unter Verwendung von Parametern, die in Abschnitt 3.5 nach 60 s beschrieben sind, und injizieren Sie anschließend eine Dosis von ca. 22 MBq [18F]FDG in einem Volumen von ca. 0,5 x 0,1 ml intravenös über das T-Stück. Spülen Sie das T-Stück anschließend mit ca. 150 l heparinisierter Salinelösung. Erwerben Sie ein dynamisches PET über 60 min und einen CT-Scan am Ende der PET-Bildgebung. Für die PET-Emissionserfassung 3600 s (60 min) in der Acquire-Option nach Zeit einstellung. Wählen Sie F-18 als Studienisotop und verwenden Sie 350–650 keV als Energielevel und 3.438 ns als Zeitfenster. Wählen Sie bei der CT-Erfassung in der Akquisitionsoption den Dämpfungsscan aus. Wählen Sie im Feld Projektionseinstellungen 120 Projektion für eine halbe Gesamtrotationaus. Wählen Sie für Die Einstellungen für Sichtfeld (FOV) und Auflösung niedrige Vergrößerung und 4 x 4 als Bindung mit 275 mm axialer Scanlänge und 3328 px als transaxiale CCD-Größeaus. Legen Sie im Feld Belichtungseinstellungen 500 A für Strom,80 kV für Spannung und 180 ms für belichtungszeitfest. Für PET-Emissionshistogramm e.B. eine Serie von 20 Bildern (6 x 10 s, 8 x 30 s, 5 x 300 s und 1 x 1800 s) als dynamische Rahmen. Wählen Sie Subtrahieren als Verzögerungenaus. Wählen Sie im Feld erweiterte Einstellungen 128 als Sinogrammbreite, 3 als Spanne, 79 als Ringdifferenz und Totzeitkorrektur. Verwenden Sie für die PET-Rekonstruktion die zweidimensionale geordnete Teilmengenerwartungsmaximierung (2D-OSEM) mit einem Streusinogramm,4 Iterationen und Fourier für die Rebinning als Rekonstruktionsalgorithmus. Wählen Sie 128 x 128 als Matrixgröße und verwenden Sie 1 als Bildzoom, alle als Frames und alle als Segmente. 4. Verfahren der manuellen Blutentnahme Führen Sie manuelle Blutentnahme 30 s, 60 s, 90 s, 600 s und 1800 s nach dem Start der bildgebenden Erfassung.HINWEIS: Eine Erhöhung der Anzahl der manuellen Blutentnahmen, insbesondere innerhalb der ersten Minute nach der Tracer-Injektion, wird nach Möglichkeit dringend empfohlen. Daher muss das Blutprobenvolumen auf 20-30 l pro Probe6reduziert werden. Öffnen Sie das erste Drei-Wege-Ventil und sammeln Sie 100 l arterielles Blut in eine kapillare Blutentnahme EDTA Tube 30 s nach Tracer-Injektion. Wiederholen Sie dies für die anderen Zeitpunkte. Bestimmen Sie das Gewicht des leeren Röhrchens und des mit Blut gefüllten Rohres. Messen Sie die Aktivität (Zählungen/Zeiteinheit) des Vollbluts für 180 s in einem Brunnenzähler, der später kreuzkalibriert wird, um Daten in kBq/mL zu erhalten. Zeichnen Sie die Startzeit der Brunnenzählermessung auf. Berechnen Sie die Aktivität des Vollbluts für jeden Zeitpunkt der manuellen Blutentnahme in kBq/mL, wenden Sie die Zerfallskorrektur an und übertragen Sie die Daten in einer Zeitaktivitätskurve. 5. Verfahren der Online-Blutentnahme Legen Sie das Rohr mit der Rohrführung in den Detektor. Starten Sie die Blutproben-Software (z.B. PSAMPLE) und öffnen Sie die Erfassungsschnittstelle. Stellen Sie sicher, dass der Computer der Online-Blutentnahme einrichtung und des PET/CT ist zeitsynchronisiert. Drücken Sie die Starttaste genau 60 s, bevor der Tracer injiziert wird, um genügend Daten für die Hintergrundkorrektur zu erfassen. Speichern Sie die Rohdaten über die Speichertaste in der PMOD-Datenbank nach der Messung. Zur Korrektur und Kalibrierung der Online-Blutdaten wechseln Sie zur Korrekturschnittstelle. Aktivieren Sie die Zerfallskorrektur und wählen Sie 18 F. Definieren Sie die Startzeit der Bildaufnahme und aktivieren Sie die Schaltfläche Durchschnitt, um die Hintergrundkorrektur durchzuführen. Aktivieren Sie die Kalibrierung und geben Sie den zuvor ermittelten Kalibrierfaktor ein (siehe Abschnitt 7.1). Speichern Sie die korrigierten und kalibrierten Blutdaten mit der Save TAC-Taste und wählen Sie die Datei blood.crv. Diese Datei kann dann als Vollbluteingangskurve in das kinetische Modellierungswerkzeug geladen werden und kinetische Modellierung kann durchgeführt werden. Entkoppeln Sie die Katheter vom zusätzlichen korporativen Shunt-System. Lösen Sie das Tier vom PET/CT-Scanner und einschläfern Sie es mit Pentobarbital.HINWEIS: In diesem Experiment wurden die Tiere nach den Messungen eingeschläfert, da Gehirne für In-vitro-Analysen im experimentellen Design verwendet wurden. Mit diesem Setup sind wiederholte Messungen in Längsstudien auch umsetzbar7. Verwenden Sie ein komplett neues Röhrensystem für das nächste Tier. 6. Bild abgeleitete Eingabefunktion Öffnen Sie das Werkzeug Sicherung auf PMOD. Laden Sie das PET-Bild als Eingang und den CT als Referenz. Klicken Sie bereits übereinstimmen. Öffnen Sie das VOXel of Interest (VOI)-Tool. Platzieren Sie den Cursor innerhalb der aufsteigenden Aorta in der CT. Klicken Sie auf vordefinierte sphärische VOI. Definieren Sie einen Radius von genau 0,7 mm. Extrahieren Sie die Zeitaktivitätsinformationen mit der VOI-Statistiktaste und kopieren Sie die gemittelten Werte in die Zwischenablage. 7. Verfahren der Kreuzkalibrierung des Twilitsystems, PET/CT und WellCounter Twilite-PET/CT-KalibrierungHINWEIS: Der vorgestellte Workflow für die Kalibrierung des Twilits basiert teilweise auf den Verfahren, die im Referenzhandbuch des PSAMPLE-Moduls von PMOD beschrieben sind.Füllen Sie eine Spritze mit ca. 100 MBq [18F]FDG. Messen Sie die genaue Aktivität AF mit einem kalibrierten Dosiskalibrator und dokumentieren Sie sie zusammen mit Datum und Uhrzeit der Messung und dem Volumen der vollständigen Spritze. Die aufgezeichnete Zeit ist der Bezugszeitpunkt für alle durchzuführenden Zerfallskorrekturen. Füllen Sie einen Becher mit 500 ml Leitungswasser. Das genaue Volumen wird durch das Wägeverfahren bestimmt. Messen Sie das Gewicht me des leeren Bechers mit einer geeigneten und kalibrierten Präzisionsskala (zumindest Genauigkeitsklasse II). Füllen Sie den Becher mit dem Leitungswasser und messen Sie das Gewicht mf des vollen Bechers. Berechnen Sie das Volumen Vb des Bechers unter Verwendung der Differenz der Masse und der Dichte des Leitungswassers (r = 0,998 g/ml bei 20 °C): Injizieren Sie die [18F]FDG in das gefüllte Becherglas und füllen Sie die leere Spritze auf ihr ursprüngliches Volumen mit inaktivem Leitungswasser auf und messen Sie die Aktivität AE der nachgefüllten Spritze im Dosiskalibrator. Die Aktivitätskonzentration cb der Lösung im Becher wird durch gegeben, die ca. 200 kBq/ml betragen sollte. Füllen Sie ein 50 ml kegelförmiges Zentrifugenrohr mit der Lösung aus dem Becherglas (große Luftblasen vermeiden) und legen Sie es zentral in das Sichtfeld des PET/CT-Scanners. Füllen Sie einen Katheter, der dem Typ des PET/CT-Bildgebungsexperiments entspricht, und legen Sie ihn in die Rohrführung des Twilitsystems. Füllen Sie den Katheter mit der Tracerlösung aus dem Becher mit der Peristaltikpumpe. Beginnen Sie die Messung der Zeitaktivitätskurve, wie in Abschnitt 5 beschrieben, mit dem gleichen Parameter für die Integrationszeit und der Rebinning wie im Experiment, ohne eine Katheterführung innerhalb des Messkopfs. Dieser Schritt stellt die Erfassung ausreichender Daten für eine entsprechende Hintergrundkorrektur sicher. Nach 2 min, ohne die Datenerfassung des Twilitsystems zu stoppen, legen Sie die Katheterführung mit dem gefüllten Rohr in den Messkopf und setzen Sie die Datenerfassung ca. 5 min fort. Starten Sie parallel eine 10 min PET-Erfassung des 50 ml konischen Zentrifugenrohres, gefolgt von einer Standard-CT-Erfassung zur Dämpfungskorrektur. Rekonstruieren Sie ein statisches PET-Bild des 50 ml konischen Zentrifugenrohrs mit demselben PET-Rekonstruktionsalgorithmus und Parametern, die in Abschnitt 3 beschrieben sind. Verwenden Sie ein nachbearbeitungsbildnes Werkzeug (z. B. PVIEW) und platzieren Sie einen zylindrischen VOI, der ca. 70% des Volumens in den rekonstruierten PET-Bildern des 50 ml konischen Zentrifugenrohrs abdeckt. Extrahieren Sie die mittlere Aktivitätskonzentration cPET in kBq/ml innerhalb des VOI. Kehren Sie zur Blutproben-Software zurück und verwenden Sie den Kalibrierungsmodus, um die erworbene TAC für Zerfall, Verzweigungsfraktion und Hintergrund zu korrigieren. Fügen Sie alle notwendigen Informationen für Nuklid, Aktivitätskonzentration und die Startzeit der PET-Erfassung hinzu. Intern extrahiert die Software die mit dem Twilitsystem gemessene Zählrate (CRtwilite) und berechnet den Kreuzkalibrierungsfaktor für PET- und Twilit-System (CFPET/twilite):HINWEIS: Es ist wichtig, dass das gleiche Isotop sowohl für Kalibrierungs- als auch für PET/CT-Experimente verwendet wird, da die Verzweigungsfraktion zwischen den verschiedenen Isotopen variiert, was bei der PET-Rekonstruktion korrigiert wird. Dieses Verfahren muss regelmäßig im Hinblick auf die Qualitätskontrolle wiederholt werden, wenn wichtige Komponenten des Systems geändert werden (z.B. Rohre, Erfassungs- und Rekonstruktionsparameter) und nach Reparaturarbeiten. PET/CT-Well-Zählerkalibrierung Um den Kalibrierfaktor CF-Gutzähler des Brunnenzählers zu berechnen, verwenden Sie die gleiche Aktivitätslösung, die im Becher für die Kalibrierung des Twilitsystems hergestellt wurde. Warten Sie ca. 6 h, um die Reduzierung der spezifischen Aktivität durch Zerfall zu ermöglichen, um totzeitliche Effekte des Szintillationsdetektors des Brunnenzählers zu minimieren. Deckeln Sie das Becherglas, um Verdunstung zu vermeiden. Berechnen Sie die genaue Zeitdifferenz zum Referenzzeitpunkt und bestimmen Sie die tatsächliche Aktivitätskonzentration cb(t+) der Lösung des Bechers, indem Sie die ursprüngliche Aktivitätskonzentration korrigieren. Pipette vordefinierte Volumina (V-Probe), die mit dem Volumen der in den Experimenten gemessenen Blutproben (z. B. 200 l) identisch sind, aus dem Becher in fünf Sicherverschlussröhrchen. Messen Sie die Aktivität jedes der fünf Rohre mit dem Brunnenzähler für 180 s.ANMERKUNG: Wenn der Variationskoeffizient für eine einzelne Messung größer als 1 % ist, sollte die Messzeit erhöht werden. Zeichnen Sie die gemessene Zählrate in Anzahl pro Minute [cpm] für jedes Rohr und die Messstartzeit auf. Führen Sie eine Zerfallskorrektur durch. Berechnen Sie den Kalibrierfaktor CFgut-zähler für jede Messung, indem Sie die zerfallskorrigierte Zählrate CR gutdurch die zerfallskorrigierte Aktivitätskonzentration des Bechers dividieren cBecher(t+): Durchschnittlich die fünf Kalibrierfaktoren, um den mittleren Kalibrierfaktor zu erhalten.