Continuous Blood Sampling in Small Animal Positron Emission Tomography/Computed Tomography Enables the Measurement of the Arterial Input Function

Teresa Mann; Jens Kurth; Anne M&#246;ller; Joanna F&#246;rster; Brigitte Vollmar; Bernd  J. Krause; Andreas Wree; Jan Stenzel; Tobias Lindner

doi:10.3791/59701

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Medicine

El muestreo sanguíneo continuo en tomografía por emisión de positrones de animales pequeños permite la medición de la función de entrada arterial

Published: August 08, 2019

doi:

10.3791/59701

Teresa Mann¹, Jens Kurth², Anne Möller³, Joanna Förster³, Brigitte Vollmar⁴, Bernd J. Krause², Andreas Wree¹, Jan Stenzel*³, Tobias Lindner*³

¹Institute of Anatomy,Rostock University Medical Center, ²Department of Nuclear Medicine,Rostock University Medical Center, ³Core Facility Multimodal Small Animal Imaging,Rostock University Medical Center, ⁴Rudolf-Zenker-Institute for Experimental Surgery,Rostock University Medical Center

Summary

Aquí se describe un protocolo para el muestreo continuo de sangre durante la toma de imágenes PET/CT de ratas para medir la función de entrada arterial (AIF). Se demuestra el cateterismo, la calibración y configuración del sistema y el análisis de datos de la radiactividad sanguínea. Los datos generados proporcionan parámetros de entrada para el modelado biocinético posterior.

Abstract

Para el análisis cuantitativo y el modelado biocinético de datos de tomografía de emisión de positrones/tomografía computarizada (PET/CT), la determinación de la concentración temporal de actividad en el tiempo en sangre también conocida como función de entrada arterial (AIF) es un punto clave, especialmente para la caracterización de modelos de enfermedades animales y la introducción de radiosondas recientemente desarrolladas. El conocimiento de la disponibilidad de radiosonda en la sangre ayuda a interpretar los datos derivados de PET/CT de la actividad tisular. Para ello, es aconsejable tomar muestras de sangre en línea durante la toma de imágenes PET/CT para medir el AIF. A diferencia del muestreo manual de sangre y los enfoques derivados de la imagen, el muestreo continuo en línea de sangre tiene varias ventajas. Además de la pérdida de sangre minimizada, hay una resolución mejorada y una precisión superior para la medición de la actividad sanguínea. Sin embargo, el principal inconveniente del muestreo de sangre en línea es la costosa y lenta preparación para cateterizar los vasos femorales del animal. Aquí, describimos un flujo de trabajo fácil y completo para el cateterismo y el muestreo continuo de sangre durante las imágenes PET/CT de animales pequeños y lo comparamos con el muestreo de sangre manual y un enfoque derivado de la imagen. Utilizando este flujo de trabajo altamente estandarizado, se demuestra la determinación del AIF de fluorodeoxiglucosa ([¹⁸F]FDG). Además, este procedimiento se puede aplicar a cualquier radiosonda en combinación con diferentes modelos animales para crear un conocimiento fundamental de las características cinéticas y del modelo de trazador. Esto permite una evaluación más precisa del comportamiento de los productos farmacéuticos, tanto para enfoques diagnósticos como terapéuticos en la investigación preclínica de enfermedades oncológicas, neurodegenerativas y miocárdicas.

Introduction

La tomografía por emisión de positrones/tomografía computarizada (PET/CT) es una tecnología de imágenes nucleares que permite la visualización de procesos metabólicos en el cuerpo después de la inyección de un ligando radioactivo etiquetado, también llamado trazador. Mientras que el ligando es una molécula que está implicada en una vía metabólica o se dirige a proteínas de la superficie celular, la etiqueta radioactiva es un radionúclido emisor de positrones. Los rayos gamma son emitidos indirectamente por la descomposición del positrón y permiten la detección de su distribución en el organismo con detectores de PET extracorpóreos. De esta manera, diferentes moléculas celulares pueden ser dirigidas: receptores de neurotransmisores y transportadores, procesos metabólicos como la glucólisis o proteínas mitocondriales como la proteína transclodor 18 kDa (TSPO) para detectar células glia activadas.

En la investigación preclínica, el PET/CT es un método atractivo para estudiar los procesos bioquímicos de una manera no invasiva in vivo, permitiendo así estudios longitudinales. Los datos PET/CT respaldan el análisis de los mecanismos de la enfermedad, la evaluación de las características y la farmacocinética de los nuevos fármacos y la validación de radiosondas actuales y novedosas para la investigación traslacional.

Durante los análisis PET/CT se pueden definir tres estados trazadores (ejemplo del modelo de compartimiento de 2 tejidos): En primer lugar, el trazador fluye dentro de la sangre después de su aplicación (estado 1; conc._[sangre]). En segundo lugar, entra en el tejido a través del lecho capilar y puede moverse libremente dentro del espacio extracelular o está inespecíficamente unido a diversas estructuras celulares o extracelulares (estado 2; conc._[unspec]). En tercer lugar, el trazador se puede enlazar específicamente (con o sin captura metabólica) a su molécula objetivo (estado 3, conc._[espec]). Todos estos procesos dinámicos entre los compartimentos son en cierta medida bidireccionales y los procesos de difusión se describen mediante constantes de velocidad (K1, k2, k3 y k4). Mientras que la concentración del marcador en la sangre (es decir, el estado 1) se llama “Entrada”, la concentración de trazador enlazado sin específicamente y específicamente (es decir, estado 2 y estado 3) se llama “Salida” y puede derivarse directamente de la imagen PET. Esta relación fisiológica se puede visualizar en el modelo de compartimiento de 2 tejidos (Figura1).

Figura 1 : El modelo compartimentado de dos tejidos. Se muestran las condiciones fisiológicas de los tres estados trazadores diferentes y los procesos dinámicos entre ellos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En el caso ideal,_[espec] es proporcional a la concentración de su molécula diana. Sin embargo, la salida de la medición PET/CT es la suma de_[spec] y conc._[unspec]. Para determinar el conc._[spec] en la región de interés, en paralelo se determina el conc._[unspec] de una región de referencia desprovista de la proteína/vía objetivo. Mediante el uso de ecuaciones matemáticas apropiadas ahora se puede calcular conc._[spec], más comúnmente utilizando el modelo de compartimiento (un enfoque de modelado biocinético). Sin embargo, en muchos casos, una región de referencia desprovista de la proteína diana no está disponible¹^,². En estos casos, el conc._[sangre] se puede utilizar para determinar conc._[espec]. Dado que el conc._[sangre] está variando debido a diferentes aclaramiento hepático y renal, excreción, flujo sanguíneo, diferente penetración de barrera cerebro-sangre y factores relacionados con la enfermedad³, el estándar de oro actual es medir el conc._{[ sangre]} en paralelo a la tomografía por emisión de arena por muestreo continuo de sangre. Esto da la función de entrada arterial (AIF), que se define como conc._[sangre] a lo largo del tiempo⁴. Cabe destacar que la realización de muestreos continuos de sangre seconsidera técnicamente muy difícil, especialmente en animales pequeños como ratas o ratones 5.

Aquí, proporcionamos un protocolo fácil y práctico para tomar muestras continuas de sangre de ratas a través de una derivación arteriovenosa (a-v) entre la vena femoral y la arteria. Junto con un sistema de bomba detector disponible comercialmente, somos capaces de generar un AIF continuo en tiempo real durante las exploraciones dinámicas [¹⁸F]fluorodeoxiglucosa ([¹⁸F]FDG)-PET/CT en ratas y lo comparamos con enfoques alternativos. Las imágenes por PET/TC se realizaron en ratas macho sprague dawley a una edad de 4 meses con un peso medio de 462 g a 33 g (media de desviación estándar) utilizando un escáner PET/CT multimodal.

Dado que se utiliza una amplia variedad de dispositivos durante la serie de mediciones (calibrador de dosis, muestreador de sangre en línea, PET/CT y contador de pozos), se necesita un procedimiento de control de calidad conocido como calibración cruzada para verificar la precisión cuantitativa de todos los sistemas y para compensar las diferencias. La calibración cruzada en el contexto del muestreo sanguíneo en línea significa que la tasa de recuento de una concentración de actividad determinada medida en imágenes PET corregidas se puede convertir en la concentración medida con el sistema de twilite para la misma concentración. Por lo tanto, se ha establecido un procedimiento de calibración cruzada entre PET/CT, sistema de muestreo de sangre y contador de pozos.

Esta metodología altamente estandarizada proporciona un enfoque potente para cuantificar los procesos metabólicos y celulares en la investigación preclínica de animales pequeños y es una manera elegante de mejorar la fiabilidad y reproducibilidad de la AIF. El AIF se puede utilizar para cuantificar el trazador específicamente unido en el tejido en datos preclínicos de PET/CT utilizando modelado biocinético.

Protocol

Todos los experimentos y manejo de animales fueron aprobados por el Comité Estatal de Investigación Animal de Mecklemburgo-Pomerania Occidental (LALLF M-V/7221.3-1.1-004/18, aprobación: 03.04.2018). Los experimentos se realizaron de conformidad con las Directrices de ARRIVE. NOTA: Los animales se mantuvieron en condiciones estándar (22 oC, ciclo de 12 h día y noche) con agua y comida ad libitum. Todos los equipos necesarios para la preparación del sistema de derivación, el procedimiento de operación y las mediciones reales se enumeran en la Tabla de materiales. 1. Preparación y procedimiento quirúrgico para el cateterismo del animal Ayuna rinde al animal durante al menos 12 h con acceso gratuito al agua. Para la anestesia, coloque la rata en una cámara de inducción y llénela continuamente con mezcla de oxígeno/isoflurano. Para el inicio utilizar 2.5-3.5% isoflurano y para mantenimiento 1.5-3.0% (tasa de flujo de 1.2-1.5 L/min).NOTA: El ayuno es necesario para los estudios que utilizan el trazador [18F]FDG pero no para otros trazadores. Se recomienda medir los niveles de glucosa en sangre mediante extracciones de sangre manuales descritas en la sección 4 para garantizar valores estables o para corregir en el modelado cinético. Coloque la rata anestesia en posición dorsal sobre una estera de calentamiento, debajo del microscopio quirúrgico y agregue un pomada de ventosa en sus ojos. Supervise y mantenga la temperatura corporal de la rata continuamente durante el experimento (37 o 0,5 oC) con una sonda rectal. Pegue las patas de la rata a la superficie de trabajo para mantener las piernas en posición. Desinfectar el lugar de operación con un desinfectante de la mucosa y afeitar la pierna y la entrepierna (lado de la operación) de la rata. Terminar con una limpieza final con el desinfectante. Haga una incisión de unos 20 mm usando fórceps quirúrgicos y tijeras en la ingle de la rata. Disecciona las capas finas de la piel y expone la vena femoral, la arteria y el nervio con los micro fórceps. Coloque dos filamentos finos debajo de cada vena femoral y arteria. Selle la vena y la arteria con cada filamento distal y mantenga bajo tensión con una abrazadera bulldog.Utilice los filamentos de sutura proximal para tensar el vaso utilizando las abrazaderas bulldog (sin nudo). Bloquee la vena con una abrazadera de aneurisma proximal, pero distal de 2-3 mm de la sutura con la abrazadera bulldog. Use tijeras corneales para hacer una pequeña incisión en la vena (1/3 del diámetro) y retire la sangre con fugas de algodón con un intercambio de algodón estéril. Dilatar la vena con un fórceps opaco y mantenerla abierta. Inserte el catéter afilado (diámetro interno [ID]: 0,58 mm, diámetro exterior [OD]: 0,96 mm) en la vena y empújelo en dirección proximal, hasta el clip de aneurisma. Abra el clip del aneurisma y empuje el catéter más lejos en dirección proximal (aproximadamente 2-3 cm), si el catéter se coloca a la derecha, la sangre fluirá hacia el catéter. Asegure el catéter con la sutura proximal haciendo dos nudos; si es necesario, coloque una sutura adicional alrededor de la vena y el catéter. Compruebe la funcionalidad del catéter lavando y aspirando con una jeringa de insulina (30 G de aguja) llena de 100 ml de solución salina heparinizada (50 unidades/ml). Coloque el catéter en la arteria repitiendo los pasos 1.6 y 1.7. Cuando ambos catéteres estén colocados correctamente, cierre la pierna con suturas y lleve al animal al PET/CT.NOTA: Tenga el más cuidado posible con los catéteres durante el transporte del animal, de lo contrario podría producirse un cambio del catéter. 2. Configuración del sistema de derivación Figura 2 : Esquema de la configuración de medición. (A) Dibujo esquemático de la configuración de medición. (B) Foto del sistema de derivación conectado con el detector de twilite, bomba peristáltica y diferentes tipos de conectores. El tiempo de radiactividad en la sangre de una rata se detecta mientras el animal (1) se escanea en el PET/CT (2). Por lo tanto, el catéter arterial (a) y venoso (b) está conectado al sistema de bomba detector a través de piezas adaptadoras (conector naranja, conector azul y conector verde). La sangre arterial se bombea desde el catéter arterial a través del detector (3) a una bomba peristáltica (4) y de vuelta al cuerpo a través del catéter venoso. Una válvula de 3 vías (7) está integrada en el sistema de tubos para realizar la inyección del trazador, extracciones de sangre manuales y enjuaguezmiento. Se monta una pieza en T (8) para inyectar actividad. El detector está conectado con un ordenador para ver, calibrar y corregir los datos sanguíneos continuos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Cortar 6 partes del tubo de polietileno de diámetro fino (FBPT) (ID: 0,58 mm, OD: 0,96 mm) con una longitud de c a 735 mm; e á 100 mm; f á 171 mm, g a 875 mm; h a 90 mm e i a 75 mm (Figura2). Corte 8 partes de los tubos de la bomba de silicona (negro/negro/negro, ID: 0,76 mm, OD: 2,48 mm) con una longitud de aproximadamente 20 mm. Coloque los conectores de reducción (de ID 2,5 mm a ID 1,5 mm) en ambos extremos del tubo de la bomba de silicona d (amarillo/azul/amarillo, ID: 1,52 mm, OD: 3,20 mm). Coloque una parte preparada de 20 mm de los tubos de silicona (negro/negro/negro) en el otro extremo de los conectores de reducción utilizados (consulte el conector azul en la Figura 2). Coloque la parte preparada c del FBPT en el conector montado azul en el extremo del tubo de la bomba de silicona d (amarillo/azul/amarillo) y la parte preparada e del FBPT en el conector montado azul en el otro extremo. Coloque una parte preparada de 20 mm de los tubos de silicona (negro/negro/negro) en los extremos de dos piezas en T 5 y 6 (ID del conector en T del tubo: 1,5 mm; véase el conector verde en la Figura 2). Conecte el extremo libre de la parte e del FBPT al lado izquierdo del conector montado en verde (5) y coloque la parte preparada f del FBPT en el lado opuesto del conector verde (5). Coloque el extremo libre de la parte f del FBPT en el lado izquierdo del conector montado verde (6) y coloque la parte preparada g del FBPT en el lado opuesto del conector verde (6). Agregue la parte preparada h del FBPT al extremo libre del conector montado verde (5) y la parte preparada i del FBPT al extremo libre del conector montado verde (6). Conecte un combi-stopper a una aguja hipodérmica (G 23 x 1 1’4”/a 0,60 mm x 30 mm) y agréguelo a una válvula de tres vías. Coloque la válvula de tres vías preparada con la aguja en el extremo libre de la parte h del FBPT. Conecte un combi-stopper a una aguja hipodérmica y coloque la aguja en el extremo libre de la parte i del FBPT.NOTA: Antes de iniciar el muestreo de sangre en línea, ver sección 5. Coloque los extremos libres de las partes c y g del FBPT en un vaso de precipitados de 100 ml lleno de 20 ml de solución salina heparinizada (50 unidades/ml). Encienda la bomba peristáltica con un caudal de 1,52 ml/min para que el sistema de derivación esté completamente lleno de la solución salina fisiológica. A continuación, ponga tres abrazaderas de tijera en los extremos de la parte c y g y en el centro de la parte i del FBPT. Suelte las abrazaderas de tijera de las partes c y g del FBPT. Conecte el catéter arterial al extremo libre de la parte c del FBPT y conecte el catéter venoso b al extremo libre de la parte g del FBPT (consulte el conector naranja en la Figura 2). 3. Adquisición y reconstrucción de imágenes Coloque al animal en posición propensa a la cabeza en el palé de la cama lanzadera (70 mm). Controle la respiración de la rata y mantenga la temperatura corporal a 37 oC a 37 oC utilizando una almohadilla de calentamiento y una sonda rectal durante la adquisición de la imagen. Mueva la cama lanzadera a la posición de la cama extendida para inyección (pre-adquisición) y conecte los catéteres insertados al sistema de derivación. Mantener al animal bajo anestesia con isoflurano (2,5% de isoflurano en oxígeno, caudal 1,2-1,5 L/min) a través de un cono nasal. Encienda la bomba peristáltica con un caudal de 1,52 ml/min para llenar el sistema de derivación con la sangre del animal. Mueva la cama lanzadera al centro del campo de visión del anillo de detección de PET e inicie el sistema de muestreo de sangre en línea (ver sección 5). Iniciar el flujo de trabajo PET/CT utilizando los parámetros descritos en la sección 3.5 después de 60 s y, posteriormente, inyectar una dosis de aproximadamente 22 MBq [18F]FDG en un volumen de aproximadamente 0,5 a 0,1 ml por vía intravenosa a través de la pieza T. Enjuague la pieza en T con unas 150 ml de solución salina heparinizada después. Adquiera un PET dinámico de más de 60 minutos y una tomografía computarizada al final de la imagen por PET. Para la adquisición de emisiones de PET, establezca 3600 s (60 min) en la opción de adquirir por tiempo. Seleccione F-18 como isótopo de estudio y utilice 350–650 keV como nivel de energía y 3.438 ns como ventana de sincronización. Para la adquisición de TC, seleccione la exploración de atenuación en la opción de adquisición. En el campo de configuración de proyección, seleccione 120 proyecciones para una rotación totalde la mitad. Para los ajustes de campo de visión (FOV) y resolución, seleccione bajo como aumento y 4 x 4 como encuadernación con longitud de escaneo axial de 275 mm y 3328 px como tamaño CCD transaxial. En el campo de ajustes de exposición, ajuste 500 oA para corriente, 80 kV para tensión y 180 ms para el tiempo de exposición. Para el histograma de emisión PET, establezca una serie de 20 fotogramas (6 x 10 s, 8 x 30 s, 5 x 300 s y 1 x 1800 s) como encuadredinámico. Seleccione Restar como retardos. Elija en el campo de configuración avanzada 128 como ancho de sinograma, 3 como intervalo, 79 como diferencia de anillo y correcciónde tiempo muerto. Para la reconstrucción de PET, utilice la maximización de la expectativa de subconjunto ordenada bidimensional (2D-OSEM) con un sinogramade generación, aplicación y guardado, 4 iteraciones y Fourier para rebinning como algoritmo de reconstrucción. Seleccione 128 x 128 como tamaño de matriz y utilice 1 como zoomde imagen, todos como fotogramas y todos como segmentos. 4. Procedimiento de muestreo manual de sangre Realice muestreos de sangre manuales de 30 s, 60 s, 90 s, 600 s y 1800 s después de iniciar la adquisición de imágenes.NOTA: Si es posible, se recomienda aumentar el número de extracciones de sangre manuales, especialmente en el primer minuto después de la inyección del trazador. Por lo tanto, el volumen de la muestra de sangre debe reducirse a 20-30 l por muestra6. Abra la primera válvula de tres vías y recoja 100 ml de sangre arterial en un tubo EDTA de recolección de sangre capilar 30 s después de la inyección del trazador. Repita el proceso para los demás puntos de tiempo. Determine el peso del tubo vacío y el tubo lleno de sangre. Mida la actividad (cuentas/unidad de tiempo) de toda la sangre durante 180 s en un contador de pozos, que posteriormente se calibra cruzadamente para obtener datos en kBq/mL. Registre la hora de inicio de la medición del contador de pozos. Calcular la actividad de sangre entera para cada punto de tiempo del muestreo de sangre manual en kBq/mL, aplicar la corrección de descomposición y transferir los datos en una curva de actividad de tiempo. 5. Procedimiento del muestreo de sangre en línea Coloque el tubo en el detector utilizando la guía del tubo. Inicie el software de muestreador de sangre (por ejemplo, PSAMPLE) y abra la interfaz de adquisición. Asegúrese de que el ordenador de la configuración de muestreo de sangre en línea y del PET/CT esté sincronizado en el tiempo. Pulse el botón de inicio exactamente 60 s antes de inyectar el trazador para adquirir suficientes datos para la corrección en segundo plano. Guarde los datos sin procesar a través del botón Guardar en la base de datos PMOD después de la medición. Para la corrección y calibración de los datos de sangre en línea, cambie a la interfaz de corrección. Habilite la corrección de decaimiento y seleccione 18 F. Defina la hora de inicio de la adquisición de la imagen y habilite el botón promedio para realizar la corrección de fondo. Active la calibración y escriba el factor de calibración previamente determinado (ver sección 7.1). Guarde los datos sanguíneos corregidos y calibrados utilizando el botón Guardar TAC y elija el archivo blood.crv. Este archivo se puede cargar como curva de entrada de sangre completa en la herramienta de modelado cinético y se puede realizar el modelado cinético. Desacople los catéteres del sistema de derivación corporal adicional. Separar al animal del escáner PET/CT y eutanasiarlo con pentobarbital.NOTA: En este experimento, los animales fueron eutanasiados después de las mediciones, ya que los cerebros se utilizaron para análisis in vitro en el diseño experimental. Con esta configuración, las mediciones repetidas en estudios longitudinales también son implementables7. Utilice un sistema de tubo completamente nuevo para el siguiente animal. 6. Función de entrada derivada de imagen Abra la herramienta Fusionarlo en PMOD. Cargue la imagen PET como entrada y la TC como referencia. Haga clic en ya coincidente. Abra la herramienta voxel of interest (VOI). Coloque el cursor dentro de la aorta ascendente en el CT. Haga clic en VOI esférico predefinido. Defina un radio de exactamente 0,7 mm. Extraiga la información de actividad de tiempo con el botón estadístico VOI y copie los valores promediados en el portapapeles. 7. Procedimiento de calibración cruzada del sistema de twilite, PET/CT y contador de pozos Calibración Twilite-PET/CTNOTA: El flujo de trabajo presentado para la calibración de la twilite se basa en parte en los procedimientos descritos en el manual de referencia del módulo PSAMPLE de PMOD.Llene una jeringa con aproximadamente 100 MBq de [18F]FDG. Mida la actividad exacta AF con un calibrador de dosis calibrado y documente junto con la fecha y hora de la medición y el volumen de la jeringa completa. El tiempo registrado es el punto de tiempo de referencia para que se realicen todas las correcciones de decaimiento. Llene un vaso de precipitados con 500 ml de agua del grifo. El volumen exacto viene determinado por el método de pesaje. Mida el peso del vaso de precipitados vacío con una escala de precisión apropiada y calibrada (al menos la clase de precisión II). Llene el vaso de precipitados con el agua del grifo y mida el peso mf del vaso de precipitados completo. Calcular el volumen Vb del vaso de precipitados utilizando la diferencia de la masa y la densidad del agua del grifo (r a 0,998 g/ml a 20 oC): Inyectar el [18F]FDG en el vaso de precipitados lleno y rellenar la jeringa vacía a su volumen original con agua del grifo inactiva y medir la actividad AE de la jeringa rellenada en el calibrador de dosis. La concentración de actividad cb de la solución en el vaso de precipitados se da por , que debe ser de aproximadamente 200 kBq/mL. Llene un tubo centrífugo cónico de 50 ml con la solución del vaso de precipitados (evitar grandes burbujas de aire) y colóquelo centralmente en el campo de visión del escáner PET/CT. Llene un catéter idéntico al utilizado en el experimento de imágenes PET/CT y colóquelo en la guía del tubo del sistema twilite. Llene el catéter con la solución del trazador del vaso de precipitados utilizando la bomba peristáltica. Inicie la medición de la curva de actividad de tiempo como se describe en la sección 5, utilizando el mismo parámetro para el tiempo de integración, y rebinning como en el experimento, sin una guía de catéter dentro del cabezal de medición. Este paso garantiza la adquisición de suficientes datos para la corrección en segundo plano adecuada. Después de 2 minutos, sin detener la adquisición de datos del sistema de twilite, coloque la guía del catéter con el tubo lleno en el cabezal de medición y continúe la adquisición de datos durante unos 5 minutos. Inicie una adquisición de PET de 10 minutos del tubo centrífugo cónico de 50 ml en paralelo seguido de una adquisición de TC estándar para la corrección de la atenuación. Reconstruya una imagen PET estática del tubo centrífugo cónico de 50 ml utilizando el mismo algoritmo de reconstrucción de PET y los mismos parámetros descritos en la sección 3. Utilice una herramienta de imágenes de postprocesamiento (por ejemplo, PVIEW) y coloque un VOI cilíndrico que cubra aproximadamente el 70% del volumen dentro de las imágenes PET reconstruidas del tubo centrífugo cónico de 50 ml. Extraiga la concentración media de actividad cPET en kBq/mL dentro del VOI. Vuelva al software del muestreador de sangre y utilice el modo de calibración para corregir el TAC adquirido para la descomposición, la fracción ramificada y el fondo. Añada toda la información necesaria para el nucleido, la concentración de actividad y la hora de inicio de la adquisición de PET. Internamente, el software extrae la tasa de recuento medida con el sistema de twilite (CRtwilite) y calcula el factor de calibración cruzada para el sistema PET y twilite (CFPET/twilite):NOTA: Es importante que el mismo isótopo se utilice tanto para la calibración como para los experimentos PET/CT, ya que la fracción de ramificación varía entre los diferentes isótopos, que se corrige en el proceso de reconstrucción de PET. Este procedimiento debe repetirse regularmente en términos de control de calidad, si se modifican componentes importantes del sistema (por ejemplo, tubos, parámetros de adquisición y reconstrucción) y después de las obras de reparación. Calibración del contador de pozos PET/CT Para calcular el contador de pozos CF del factor de calibración del contador de pozos, utilice la misma solución de actividad que se ha producido en el vaso de precipitados para la calibración del sistema de twilite. Espere aproximadamente 6 horas para permitir la reducción de la actividad específica por descomposición para minimizar los efectos de tiempo muerto del detector de centelleo del contador de pozos. Tapa el vaso de precipitados para evitar la evaporación. Calcular la diferencia horaria exacta en el punto de tiempo de referencia y determinar la concentración de actividad real cb(t+) de la solución del vaso de precipitados corrigiendo la concentración de actividad original. Volúmenes predefinidos de pipeta (muestraen V) que son idénticos al volumen de las muestras de sangre medidas dentro de los experimentos (por ejemplo, 200 l), desde el vaso de precipitados en cinco tubos de bloqueo seguro. Mida la actividad de cada uno de los cinco tubos con el contador del pozo para 180 s.NOTA: Si el coeficiente de variación para una sola medición es superior al 1%, se debe aumentar el tiempo de medición. Registre la tasa de recuento medida en recuentos por minuto [cpm] para cada tubo y la hora de inicio de la medición. Realice una corrección de decaimiento. Calcular el factor de calibración CFpozo-contador para cada medición dividiendo la tasa de recuento corregida de descomposición CRbien-contador del contador de pozos por la concentración de actividad corregida de descomposición del vaso de precipitados cbeaker(t+): Promedio de los cinco factores de calibración para obtener el factor de calibración medio.

Representative Results

La configuración del sistema de derivación se muestra en la Figura2. Los resultados representativos de los datos continuos de muestreo de sangre en comparación con los datos manuales de muestreo de sangre en tres ratas de tipo salvaje durante un intervalo de tiempo de 30 min se presentan en la Figura 3A,C. Al comienzo del muestreo continuo de sangre, se puede ver un pico inicial (máximo de concentración de radiactividad) a los 5 s después de la inyección del trazador. Después, la actividad en la sangre disminuye rápidamente y alcanza una meseta a unos 15 minutos. En los datos de muestreo de sangre manual el pico detectado es más pequeño y la meseta no es fácil de definir (Figura3A,C). La comparación del muestreo sanguíneo continuo con los datos derivados de la imagen se muestra en la Figura 3B,D. En los datos derivados de la imagen, el pico y el punto de partida de la meseta son claramente visibles, sin embargo, el máximo del pico es más pequeño en comparación con los datos continuos de muestreo de sangre para todos los animales (Figura3B,D). Un resultado subóptimo del muestreo continuo de sangre con nuestra configuración se muestra en la Figura 3E,F. Al comienzo del muestreo continuo de sangre, no fue posible la adquisición de datos en los primeros 3,5 minutos debido a la coagulación de la sangre. Al desconectar el sistema de tubos en el conector naranja y flotar con solución salina heparinizada, se reinició el flujo en el sistema de tubos y la medición continuó. Un pico se puede ver en aproximadamente 4 min, que no registra el máximo de radiactividad en la sangre (Figura3E,F). El muestreo de sangre manual (Figura3E) y los análisis derivados de imágenes (Figura3F) seguían siendo posibles y comparables a los resultados correctos. Figura 3 : Resultados representativos del muestreo continuo de sangre en comparación con el muestreo de sangre manual. Se muestran las funciones típicas de entrada arterial derivadas del muestreo sanguíneo continuo en comparación con el muestreo de sangre manual (columna izquierda) y el muestreo sanguíneo continuo en comparación con el enfoque derivado de la imagen (columna derecha). Los paneles A-D demuestran los resultados de la correcta aplicación del protocolo en dos animales diferentes. Los paneles E y F ilustran un resultado subóptimo de la medición. Todos los datos mostrados se corrigieron para el factor de calibración cruzada y el fondo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Los resultados presentados se extraen de un proyecto a gran escala sobre la actividad neuronal en un modelo animal transgénico de la enfermedad de Huntington en comparación con ratas de tipo salvaje. En total se cateterizaron 30 ratas transgénicas y de tipo salvaje y se realizaron muestreos de sangre manuales y en línea en paralelo a [¹⁸F]FDG-PET/CT. Tres AIF de ratas de tipo salvaje se muestran aquí para demostrar la gama de posibles resultados del protocolo. Los resultados del proyecto completo sobre los cambios de actividad neuronal en un modelo animal de la enfermedad de Huntington se publicarán en otros lugares.

El método aquí descrito permite un muestreo continuo de sangre rápido y preciso en una cohorte grande y proporciona un AIF sin espacio para el modelado cinético de datos dinámicos de PET/CT en animales pequeños. Se genera una circulación sanguínea externa para detectar la actividad de tiempo real en la sangre de los animales; consecuentemente se evita una pérdida de sangre. El procedimiento quirúrgico se basa en Jespersen et al.⁸ y fue modificado para satisfacer las necesidades de muestreo de sangre arterial durante las mediciones de PET/CT. El sistema de derivación fue validado por Weber et al.⁹. Con la configuración aquí utilizada, un volumen de sangre externo de aproximadamente 1,1 ml está corriendo a través del sistema detector-bomba. Una rata de 4 meses de edad tiene un volumen total de sangre de unos 30 ml. El diámetro de la vena femoral y la arteria es de aproximadamente 0,45-0,6 mm¹⁰ y debe ser un poco almidonado para insertar el catéter utilizado.

El AIF también se puede medir mediante la recolección manual esporádica de sangre o reconstruirse a partir de los primeros puntos de tiempo de las propias imágenes PET (derivadas de la imagen). Ambos enfoques se realizaron con los datos presentados aquí y se compararon con el muestreo continuo de sangre.

En comparación con el muestreo de sangre manual, con el muestreo de sangre en línea una resolución temporal notablemente mayor (aquí: 1800 puntos de datos por 30 min) se hace posible. Los sorteos manuales de sangre (aquí: 5 puntos de datos por 30 min) se limitan al volumen sanguíneo presente en el animal pequeño, ya que estas muestras no se bombean de nuevo a la circulación del animal. Además, un intervalo máximo de 10-15 s es técnicamente implementable y se pierde información importante para el modelado cinético. Esto también se puede ver en los datos presentados, ya que es evidente una diferencia en el máximo detectado de muestreo sanguíneo continuo y manual (Figura3A,C,E). Con el muestreo de sangre en línea, el pico detectado fue mayor que con la función de entrada derivada de la imagen de la aorta ascendente¹¹ (Figura3B,D,F). La función de entrada derivada de imágenes está restringida a la resolución espacial de los escáneres PET, lo que da como resultado efectos de volumen parciales¹² y se ve afectada por los marcos de tiempo reconstruidos.

Una ventaja general de este procedimiento continuo de muestreo de sangre es que el marcador se puede aplicar a través del catéter, que es menos propenso a la perturbación que la inyección a través de la vena posterior lateral. Tenga en cuenta que el trazador debe aplicarse en un volumen moderado para evitar que el trazador permanezca al principio del sistema de tubos. Para asegurarse de que no queda actividad en el volumen muerto de la pieza en T, se lava con solución salina heparinizada después. Además, se aconseja el uso de una bomba de perfusión, ya que permite ajustar la velocidad de la inyección del trazador y puede contribuir a una adquisición más coordinada del pico máximo de radiactividad con muestreo de sangre manual¹³.

Hay algunas dificultades posibles que pueden ocurrir durante el procesamiento del protocolo y se pueden manejar mediante la siguiente solución de problemas. Una posición subóptima de los catéteres podría conducir a una ejecución incompleta del protocolo, por lo tanto, asegúrese de que se fijan con precisión con la sutura proximal y que el catéter se empuja 2-3 cm proximal en el vaso. Además, se puede utilizar adhesivo de fibrina. También la formación de trombos puede obstruir los catéteres. Esto se puede manejar aumentando la concentración de heparina y posterior lavado de los catéteres o el sistema de tubos. Tal resultado subóptimo debido a la obstrucción de los catéteres se muestra en los resultados, se omite el pico máximo (Figura3E). Otro punto crítico con respecto a la protección y el bienestar animal es la longitud del flujo sanguíneo extracorpóreo. Por lo tanto, se sugiere reducir la longitud del sistema de tubos al mínimo.

Cuando se realiza un muestreo de sangre, deben tenerse en cuenta tres correcciones del AIF resultante. Primero, corrección plasmática. Los trazadores equilibran entre plasma y células sanguíneas, principalmente eritrocitos. Dependiendo de la rapidez con que sean estos procesos de difusión, el trazador disponible está presente principalmente en el plasma. Para algunos trazadores, es necesario considerar la proporción de plasma a sangre entera, como los más lipofílicos. En estos casos, se debe determinar la actividad plasmática. Si se utiliza [¹⁸F]FDG, no hay necesidad de centrifugar la sangre para determinar la actividad plasmática, ya que equilibra muy rápido entre el plasma y los glóbulos rojos y la disponibilidad de [¹⁸F]FDG en plasma es similar a la de toda la sangre. En segundo lugar, la corrección de metabolitos. Muchos trazadores se metabolizan en sangre entera y algunos de estos metabolitos todavía están etiquetados radiactivamente^14. Esta fracción está presente en el AIF, pero no está disponible para la acumulación de tejido. Para algunos trazadores, es necesario determinar metabolitos en sangre entera o plasma y es necesario corregir el AIF. En tercer lugar, corrección de dispersión. La dispersión es causada por varios factores, incluyendo (a) la diferencia de tiempo sistemática entre los tiempos de llegada del trazador en el tejido en relación con el sitio de muestreo periférico (corrección de retardo) y (b) y el frotis de la forma del AIF, como el transportador del trazador dentro del sistema de tubos está influenciadopor su cinética de primer orden de retraso (PT 1). Se han propuesto varias correcciones basadas en la desconvolución, basadas principalmente en el modelo de Iida et al.¹⁵, pero la mayoría de ellas son susceptibles al ruido. Munk et al.¹⁶ha propuesto un método de corrección que elude la desconvolución y, por lo tanto, es menos propenso al ruido. Las mediciones necesarias para estimar los parámetros de corrección deben realizarse para cada combinación de tubos y trazadores utilizados. La corrección de dispersión debe realizarse antes de la corrección de retardo de tiempo¹⁷. Sin embargo, los procesos de perfusión tisular principalmente rápidos se ven afectados por la dispersión y también se ha demostrado, que para el modelado de [¹⁸F]FDG estudios una corrección de dispersión no es absolutamente necesario¹⁸. Por lo tanto, en los ejemplos presentados no se ha aplicado la corrección de dispersión del AIF.

Una calibración adecuada del calibrador de dosis in situ y su control de calidad regular es un requisito previo para el tipo de procedimientos de calibración cruzada que se presentan aquí. Sin embargo, si la actividad administrada al animal se mide con el mismo calibrador de dosis, se cancelará cualquier desviación de precisión, siempre que la desviación sea constante y se haya seguido el procedimiento completo de calibración cruzada, correcciones específicas de nuciledos (por ejemplo, para diferentes medias vidas o diferentes proporciones de ramificación). Mediante este procedimiento de calibración para armonizar los sistemas PET/CT utilizados en la investigación y el cuidado de la salud humana, se podría lograr una precisión de al menos el 5-10%^{de 19}^,²⁰.

Los AIF calibrados y corregidos generados por la implementación exitosa de este protocolo permiten cuantificar los datos PET/CT para la caracterización de modelos de enfermedades animales, probar nuevas opciones terapéuticas, establecer nuevos trazadores y transferir trazadores existentes en otra especie. Aparentemente, el muestreo continuo de sangre en [¹⁸]FDG-PET/CT en ratas proporciona la información más fiable para el cálculo de la entrada en el modelado biocinético. Teniendo en cuenta el metabolismo individual, especialmente el aclaramiento hepático, es posible una evaluación más precisa de los efectos patológicos o terapéuticos pertinentes. Con este protocolo factible, una mayor eficiencia del análisis de datos PET/CT preclínico es fácilmente implementable.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores reconocen con gratitud a Susann Lehmann, Iloana Klamfu y Petra Wolff por su alojamiento y cuidado de animales y Matthias Wyss por su apoyo durante el establecimiento del sistema de muestreo de sangre en línea. El animal pequeño PET/CT fue financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (INST 2268/6-1 FUGG).

Materials

Sugery for arteriovenous shunt
anesthesia station	Groppler
aneurysm clips	Aesculap	FT190T	5 mm, closing force 70 g
bulldog clamp	Aesculap		35 mm
dissectiong scissors BC165	Aesculap	490-866	dull, for skin preparation
heating mat
insulin syringe	Braun		30G
needle holder	medicon	11.62.18	micro surgical
pliers for aneurysm clips	Aesculap	FT 470T	Yasargil
portex fine bore polythene tubing	Smith Medical	800/100/200	ID 0.58 mm, OD 0.96 mm; PE50 equivalent tubing
surgical microscope with camera	Leica		M50 + MC120 HD
suture filaments 6.0			6.0, polypropylene
suture filaments 3.0			3.0, absorbable, braided
two anatomical forceps	Hammacher Soling	HSC601-11	micro surgery, 45°
vascular or corneal scissors	Geuder	G19605	micro surgery scissors
PET/CT imaging
dose calibrator ISOMED 2010	nivia instruments GmbH		for tracer portioning
Inveon PET/CT	Siemens
tracer (e.g. 18F-FDG)
manuel bloodsampling
capillary blood collection EDTA tube	KABE Labortechnik GmbH		GK 150 EDTA 200 µl
test tubes	SARSTEDT		5 ml, 75 x 12 mm, PS
well counter CAPTUS 700t	Capintec		manuel measurement of blood activity
automatic blood sampling
BD Venflon TM pro safety shielded IV catheter; 18 G (1.3 mm x 32 mm)	BD	3932269	luer connections (to fit in t-connections)
bloodsampler twilite two	swisstrace GmbH
combi stopper	Braun	4495101
heparin			50U/ml for tube flushing before the experiment and aspiration during catheter surgery
hypodermic needle			G23 x 1 1/4" / 0.6 x 30 mm
microprocessor controlled tubing pump	Ismatec/Cole-Parmer	ISM596	12 rollers, 2 channels
PSAMPLE modul of PMOD	PMOD
reduction connectors	Ismatec/Cole-Parmer	ISM569A	from ID 2.5 mm to ID 1.5 mm
silicone pump tubes	Ismatec/Cole-Parmer	070535-17-ND /SC0065N	for roller pump (yellow/blue/yellow ID 1.52 mm, WT 0.84 mm, OD 3.2 mm)
silicone pump tubes – adapter tubing	Ismatec/Cole-Parmer	SC 0107	black/black/black ID 0.76 mm, WT 0.86 mm, OD: 2.48 mm
t-piece or t-connections	Ismatec/Cole-Parmer	ISM 693A	ID 2.5 mm

References

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Mann, T., Kurth, J., Möller, A., Förster, J., Vollmar, B., Krause, B. J., Wree, A., Stenzel, J., Lindner, T. Continuous Blood Sampling in Small Animal Positron Emission Tomography/Computed Tomography Enables the Measurement of the Arterial Input Function. J. Vis. Exp. (150), e59701, doi:10.3791/59701 (2019).

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