Конвекционные расширенные поставки (CED) является методом, позволяющим эффективной доставки терапии в мозг путем прямого перфузии больших объемов тканей. Процедура требует использования катетеров и оптимизированной процедуры инъекций. Этот протокол описывает методологию CED антитела в мозг мыши.
Конвекционные расширенные поставки (CED) является нейрохирургической техникой, позволяющей эффективно перфузии больших объемов мозга с помощью системы катетера. Такой подход обеспечивает безопасный метод доставки путем прохождения гематоэнцефалического барьера (BBB), что позволяет лечение с терапевтическими с плохой BBB-проницаемость или те, для которых системное воздействие не желательно, например, из-за токсичности. CED требует оптимизации конструкции катетера, протокола инъекций и свойств инфузата. С помощью этого протокола мы описываем, как выполнять CED раствора, содержащего до 20 мкг антитела в каудат путамины мышей. Он описывает подготовку шага катетеров, тестирование их в пробирке и выполнения CED у мышей с помощью рампы программы инъекций. Протокол может быть легко скорректирован для других объемов инфузии и может быть использован для инъекций различных трассаторов или фармакологически активных или неактивных веществ, включая химиотерапию, цитокины, вирусные частицы и липосомы.
Гематоэнцефалический барьер (BBB) образует полупроницаемую границу, отделяющую центральную нервную систему (ЦНС) от кровообращения. Достижение ЦНС с терапевтическими, однако, необходимо в контексте различных заболеваний, как опухоли головного мозга, болезнь Альцгеймера (AD) или болезнь Паркинсона (PD) среди других1. Это становится важным в разработке новых методов лечения, особенно если проверенный препарат проявляет плохую проницаемость BBB или его системное воздействие может привести к опасной токсичности1,2. Некоторые из клинически используемых антител отображают обе эти особенности. Решение этой проблемы было бы доставить терапии непосредственно за BBB.
Конвекционные усовершенствованные роды (CED) – нейрохирургическая методика, позволяющая эффективно перфузить больших объемов мозга. Это достигается хирургическим путем установки одного или нескольких катетеров в целевой области. Во время применения препарата при открытии катетера образуется градиент давления, который становится движущей силой дисперсии инфузата в ткани3,4. Таким образом, продолжительность инфузии, а не диффузионные коэффициенты определяют диапазон перфузии2,4,5. Это обеспечивает равномерное доставки инфузата в течение гораздо большего объема мозга по сравнению с обычными, диффузии на основе методов внутримозговой инъекции2,6. В то же время, эта модальность доставки имеет более низкий риск повреждения тканей2. Соответственно, CED может обеспечить безопасное и эффективное введение обычных химиотерапевтических методов лечения опухолей ЦНС, а также доставку иммуномодулирующих средств или агонистических и антагонистических антител во множестве других расстройств ЦНС2 ,7,8,9. CED в настоящее время тестируется в терапии болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, а также полноценной глиомы2,7,8,10,11.
Конструкция катетера и режим инъекций являются одними из наиболее важных факторов, влияющих на исход CED 10,12,13,14,15,16. Кроме того, он требует специфических физико-химических свойств инфузата, включая умеренный размер частиц, анионический заряд и сродство низкой ткани 10,17. Каждый из этих параметров должен быть потенциально скорректирован в соответствии с гистологическими особенностями области мозга, которые будут направлены2,10,17.
Здесь мы описываем методологию для выполнения CED раствора антител в caudate putamen (striatum) мышей. Кроме того, протокол включает в себя подготовку ступенчатых катетеров в лабораторной установке, тестирование их в пробирке и выполнение CED.
Есть несколько конструкций катетера доступны в литературе, отличаясь по форме канюли, используемых материалов и количество катетер отверстия12,15,18,19,20 ,21,22. Мы используем ступенчатый катетер из сросшёрного капилляра, выступающего на 1 мм от тупой металлической иглы. Этот катетер дизайн может быть легко изготовлены в исследовательской лаборатории и воспроизводимо дает хорошие результаты CED при тестировании в пробирке с агарозными блоками с физическими параметрами, напоминающими мозг parenchyma in vivo23.
Кроме того, мы внедряем режим наращивания для доставки 5 зЛ инфусата in vivo. В таком протоколе скорость инъекций увеличивается с 0,2 л/мин до максимума 0,8 л/мин, тем самым сводя к минимуму вероятность инфузатного рефлюкса вдоль катетера, а также риск повреждения тканей16. Используя этот протокол, мы успешно вводили мышам до 20 мкг антител в 5 Л ПБС в течение 11 мин 30 с.
Протокол может быть легко скорректирован для других объемов инфузии или для инъекций различных других веществ, например, химиотерапевтических препаратов, цитокинов, вирусных частиц или липосом2,10,14,18 ,22. В случае использования инфузата с кардинально различными физикохимическими свойствами по сравнению с фосфатным буферным сольником (PBS) или искусственным спинномозговой жидкостью (aCSF) раствором антител рекомендуется, рекомендуются дополнительные шаги проверки. Для сборки катетера, проверки и CED мы описываем все шаги с помощью стереотаксического робота с дрелью и инъекционным блоком, установленным на обычную стереотаксическую раму. Эта процедура также может быть выполнена с ручной стереотаксической рамой, подключенной к программируемому микроинфузионному насосу, который может управлять описанными стеклянными микросилиями.
Конвекционно-увеличенная поставка, или давление-опосредованное инфузия снадобья в мозг, сперва была предложена в начале 19903. Этот подход обещает perfusion больших объемов мозга за гематоэнцефалический барьер в контролируемой манере2. Тем не менее, до сих пор, тольк…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантами Цюрихского университета (FK-15-057), Фонда новартисов по медико-биологическим исследованиям (16C231) и Швейцарского онкологического исследования (KFS-3852-02-2016, KFS-4146-02-2017) Иоганнесу Фому Бергу и BRIDGE Proof of Concept (20B1-1 177300) Линде Шеллхаммер.
10 μL syringe | Hamilton | 7635-01 | |
27 G blunt end needle | Hamilton | 7762-01 | |
Agarose | Promega | V3121 | |
Atipamezol | Janssen | ||
Bone wax | Braun | 1029754 | |
Buprenorphine | Indivior Schweiz AG | ||
Carprofen | Pfizer AG | ||
Dental drill bits, steel, size ISO 009 | Hager & Meisinger | 1RF009 | |
Ethanol 100% | Reuss-Chemie AG | 179-VL03K-/1 | |
Fentanyl | Helvepharm AG | ||
FITC-Dextran, 2000 kDa | Sigma Aldrich | FD2000S | |
Flumazenil | Labatec Pharma AG | ||
Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775-500ML | |
High viscosity cyanoacrylate glue | Migros | ||
Iodine solution | Mundipharma | ||
Medetomidin | Orion Pharma AG | ||
Microforge | Narishige | MF-900 | |
Midazolam | Roche Pharma AG | ||
Ophthalmic ointment | Bausch + Lomb | Vitamin A Blache | |
PBS | ThermoFischer Scientific | 10010023 | |
Polyclonal goat anti-rat IgG (H+L) antibody coupled with Alexa Fluor 647 | Jackson Immuno | ||
Scalpels | Braun | BB518 | |
Silica tubing internal diameter 0.1 mm, wall thickness of 0.0325 mm | Postnova | Z-FSS-100165 | |
Stereotactic frame for mice | Stoelting | 51615 | |
Stereotactic robot | Neurostar | Drill and Injection Robot | |
Succrose | Sigma Aldrich | S0389-500G | |
Topical tissue adhesive | Zoetis | GLUture | |
Trypan blue | ThermoFischer Scientific | 15250061 | |
Water | Bichsel | 1000004 |