Entrega de anticorpos para o cérebro murino via convecção-fornecimento aprimorado

A barreira hematoencefálica (BBB) forma uma borda semipermeável separando o sistema nervoso central (SNC) da circulação sanguínea. Alcançar o CNS com terapêutica é entretanto necessário no contexto de várias doenças, como tumores cerebrais, doença de Alzheimer (AD) ou doença de Parkinson (PD) entre outros¹. Isto torna-se importante no desenvolvimento de novas terapias, especialmente se a droga testada exibe permeabilidade BBB pobre ou a sua exposição sistémica pode levar a toxicidade perigosa^1,2. Alguns dos anticorpos clinicamente utilizados exibem ambas estas características. Uma solução para este problema seria a de entregar a terapêutica diretamente por trás do BBB.

A entrega reforçada por convecção (CED) é uma técnica neurocirúrgica que permite a perfusão efetiva de grandes volumes cerebrais. Isto é conseguido cirurgicamente instalando um ou mais cateteres na área alvo. Durante a aplicação da droga, um gradiente de pressão é formado na abertura do cateter, que se torna a força motriz da dispersão do infusato no tecido^3,4. É, portanto, a duração da infusão e não os coeficientes de difusão que determinam a faixa de perfusão^2,4,5. Isto fornece a entrega uniforme do infusato sobre um volume muito maior do cérebro comparado ao convencional, a difusão baseou métodos intracerebral da injeção^2,6. Ao mesmo tempo, esta modalidade da entrega tem um risco mais baixo de dano de tecido². Consequentemente, o CED pode permitir a administração segura e eficaz da quimioterapêutica convencional para o tratamento de tumores do CNS, assim como a entrega de agentes imunomoduladores ou de anticorpos agonístico e antagônicas em uma multidão de outras desordens do CNS^{2 ,7,8,9}. CED é atualmente testado em terapias da doença de Parkinson, a doença de Alzheimer, bem como glioma de alto grau^2,7,8,10,11.

O delineamento do cateter e o esquema de injeção estão entre os fatores mais importantes que influenciam o desfecho do CED ^{10,12,13,14,15,16}. Além disso, requer propriedades físico-químicas específicas do infusato, incluindo tamanho moderado das partículas, carga aniônica e baixa afinidade tecidual ^10,17. Cada um destes parâmetros tem que ser ajustado potencialmente de acordo com as características histológicas da região do cérebro a ser alvejada^2,10,17.

Aqui nós descrevemos a metodologia para executar o CED de uma solução do anticorpo no putamen caudado (striatum) dos ratos. Além disso, o protocolo inclui a preparação de cateteres de degrau em uma instalação laboratorial, testando-os in vitro e realizando o CED.

Existem vários projetos de cateter disponíveis na literatura, diferindo pela forma da cânula, os materiais utilizados e o númerode aberturas de cateter^{12,15,18,19,20 ,21,22}. Nós estamos usando um cateter da etapa feito de um capilar fundido do silicone que projeta 1 milímetro de uma agulha sem corte do metal da extremidade. Este projeto do cateter pode facilmente ser manufacturado em um laboratório de pesquisa e dá resultados bons de CED quando testado in vitro com blocos do agarose com parâmetros físicos que assemelham-se ao parênquima do cérebro in vivo²³.

Além disso, nós implementamos um regime de rampa para a entrega de 5 μL de infusato in vivo. Em tal protocolo, a taxa de injeção é aumentada de 0,2 μL/min para um máximo de 0,8 μL/min, minimizando assim as chances de refluxo infusato ao longo do cateter, bem como o risco de dano tecidual¹⁶. Usando este protocolo, nós administramos com sucesso ratos com os até 20 μg do anticorpo em 5 μL de PBS sobre o curso de 11 minutos 30 s.

O protocolo pode ser prontamente ajustado para outros volumes de infusão ou para injetar várias outras substâncias, por exemplo, quimioterápicos, citocinas, partículas virais ou lipossomas^{2,10,14,18 ,22}. Em caso do uso do infusato com propriedades físico-químicas drasticamente diferentes comparadas a uma solução salina tamponada fosfato (PBS) ou do líquido cerebrospinal artificial (ACSF) de anticorpos, as etapas adicionais da validação são recomendadas. Para o conjunto do cateter, a validação e o CED, nós descrevemos todas as etapas usando um robô stereotactic com uma unidade da broca e da injeção montada em um frame stereotactic regular. Este procedimento pode igualmente ser executado com um frame stereotactic manual conectado à bomba programável da microinfusão que pode conduzir as Microseringas de vidro descritas.