Un ensayo semicuantitativo de estabilidad de objetivos sensibles a la afinidad de drogas (DARTS, por sus) para estudiar la interacción con Rapamicina/mTOR
Summary
En este estudio, mejoramos las capacidades de análisis de datos del experimento DARTS mediante el seguimiento de los cambios en la estabilidad de las proteínas y la estimación de la afinidad de las interacciones proteína-ligand. Las interacciones se pueden trazar en dos curvas: una curva proteolítica y una curva de dependencia de dosis. Hemos utilizado la interacción mTOR-rapamicina como un caso ejemplar.
Abstract
La estabilidad de objetivos sensibles a la afinidad de fármacos (DARTS) es un método robusto para la detección de nuevos objetivos de proteínas de moléculas pequeñas. Se puede utilizar para verificar las interacciones molécula-proteína seres(as) conocidas y para encontrar posibles dianas proteicas para productos naturales. En comparación con otros métodos, DARTS utiliza moléculas nativas, no modificadas, pequeñas y es simple y fácil de operar. En este estudio, mejoramos aún más las capacidades de análisis de datos del experimento DARTS mediante el seguimiento de los cambios en la estabilidad de las proteínas y la estimación de la afinidad de las interacciones proteína-ligand. Las interacciones proteína-ligand se pueden trazar en dos curvas: una curva proteolítica y una curva de dependencia de dosis. Hemos utilizado la interacción mTOR-rapamicina como un caso ejemplar para el establecimiento de nuestro protocolo. De la curva proteolítica vimos que la proteólisis de mTOR por pronasa fue inhibida por la presencia de rapamicina. La curva de dependencia de dosis nos permitió estimar la afinidad vinculante de rapamicina y mTOR. Es probable que este método sea un método potente y sencillo para identificar con precisión nuevas proteínas diana y para la optimización de la participación objetivo de fármacos.
Introduction
La identificación de proteínas diana de moléculas pequeñas es esencial para la comprensión mecanicista y el desarrollo de fármacos terapéuticos potenciales1,2,3. La cromatografía de afinidad, como método clásico para identificar las proteínas diana de moléculas pequeñas, ha dado buenos resultados4,5. Sin embargo, este método tiene limitaciones, en que la modificación química de moléculas pequeñas a menudo resulta en una especificidad o afinidad de unión reducida o alterada. Para superar estas limitaciones, recientemente se han desarrollado y aplicado varias estrategias nuevas para identificar los objetivos de moléculas pequeñas sin modificación química de las moléculas pequeñas. Estos métodos directos para la identificación diana de moléculas pequeñas sin etiquetas incluyen la estabilidad objetivo sensible a la afinidad de los fármacos (DARTS)6, la estabilidad de las proteínas a partir de las tasas de oxidación (SPROX)7, el ensayo de cambio térmico celular (CETSA)8 ,9, y perfilado de proteome térmico (TPP)10. Estos métodos son muy ventajosos porque utilizan moléculas pequeñas naturales y no modificadas y dependen únicamente de interacciones de unión directa para encontrar proteínas objetivo11.
Entre estos nuevos métodos, DARTS es una metodología comparativamente simple que puede ser fácilmente adoptada por la mayoría de los laboratorios12,13. DARTS depende del concepto de que las proteínas ligadas a ligando de ligando demuestran la susceptibilidad modificada a la degradación enzimática en relación con las proteínas no unidas. La nueva proteína diana se puede detectar mediante el examen de la banda alterada en gel SDS-PAGE a través de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS/MS). Este enfoque se ha implementado con éxito para la identificación de objetivos previamente desconocidos de productos naturales y medicamentos14,15,16,17,18, 19. También es potente como medio para detectar o validar la unión de compuestos a una proteína específica20,21. En este estudio, presentamos una mejora en el experimento mediante el seguimiento de los cambios en la estabilidad de proteínas con moléculas pequeñas y la identificación de afinidades de unión proteína-ligand. Utilizamos la interacción mTOR- rapamicina como ejemplo para demostrar nuestro enfoque.
Protocol
Representative Results
Discussion
DARTS permite la identificación de pequeñas dianas de moléculas explotando el efecto protector de la unión a proteínas contra la degradación. DARTS no requiere ninguna modificación química o inmovilización de la molécula pequeña26. Esto permite utilizar moléculas pequeñas para determinar sus objetivos de proteína de unión directa. Los criterios de evaluación estándar para el método Clásico DARTS incluyen la tinción de gel, espectrometría de masas y la hincha occidental<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por las becas de investigación DE NIH R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484, y una beca de investigación del Departamento de Defensa W81XWH-16-1-0482.
Materials
| 100X Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | Dilute to 20X with ultrapure water |
| 293T cell line | ATCC | CRL-3216 | DMEM medium with 10% FBS |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cell scraper | Thermo Fisher | 179693 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution | Bio-Rad | 1610436 | |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 6.0 | statistical analysis and drawing software |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52 | image processing and analysis software |
| M-PER Cell Lysis Reagent | Thermo Fisher | 78501 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | R21-040-CV | |
| Pronase | Roche | PRON-RO | 10 mg/ml |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | 221368 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | adjust to pH 8.0 |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |
References
- Rask-Andersen, M., Masuram, S., Schioth, H. B. The druggable genome: Evaluation of drug targets in clinical trials suggests major shifts in molecular class and indication. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 9-26 (2014).
- O’Connor, C. J., Laraia, L., Spring, D. R. Chemical genetics. Chemical Society Reviews. 40 (8), 4332-4345 (2011).
- McFedries, A., Schwaid, A., Saghatelian, A. Methods for the elucidation of protein-small molecule interactions. Chemistry & Biology. 20 (5), 667-673 (2013).
- Sato, S., Murata, A., Shirakawa, T., Uesugi, M. Biochemical target isolation for novices: affinity-based strategies. Chemistry & Biology. 17 (6), 616-623 (2010).
- Sleno, L., Emili, A. Proteomic methods for drug target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 12 (1), 46-54 (2008).
- Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).
- Strickland, E. C., et al. Thermodynamic analysis of protein-ligand binding interactions in complex biological mixtures using the stability of proteins from rates of oxidation. Nature Protocols. 8 (1), 148-161 (2013).
- Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Savitski, M. M., et al. Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome. Science. 346 (6205), 1255784 (2014).
- Chang, J., Kim, Y., Kwon, H. J. Advances in identification and validation of protein targets of natural products without chemical modification. Natural Product Reports. 33 (5), 719-730 (2016).
- Pai, M. Y., et al. Drug affinity responsive target stability (DARTS) for small-molecule target identification. Methods in Molecular Biology. 1263, 287-298 (2015).
- Lomenick, B., Jung, G., Wohlschlegel, J. A., Huang, J. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 163-180 (2011).
- Xu, L., et al. Precision therapeutic targeting of human cancer cell motility. Nature Communications. 9 (1), 2454 (2018).
- Lim, H., et al. A novel autophagy enhancer as a therapeutic agent against metabolic syndrome and diabetes. Nature Communications. 9 (1), 1438 (2018).
- Schulte, M. L., et al. Pharmacological blockade of ASCT2-dependent glutamine transport leads to antitumor efficacy in preclinical models. Nature Medicine. 24 (2), 194-202 (2018).
- Skrott, Z., et al. Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer via p97 segregase adaptor NPL4. Nature. 552 (7684), 194-199 (2017).
- Zhang, C., et al. Endosidin2 targets conserved exocyst complex subunit EXO70 to inhibit exocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 41-50 (2016).
- Chin, R. M., et al. The metabolite alpha-ketoglutarate extends lifespan by inhibiting ATP synthase and TOR. Nature. 510 (7505), 397-401 (2014).
- Robinson, T. J., et al. High-throughput screen identifies disulfiram as a potential therapeutic for triple-negative breast cancer cells: interaction with IQ motif-containing factors. Cell Cycle. 12 (18), 3013-3024 (2013).
- Aghajan, M., et al. Chemical genetics screen for enhancers of rapamycin identifies a specific inhibitor of an SCF family E3 ubiquitin ligase. Nature Biotechnology. 28 (7), 738-742 (2010).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
- Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
- Van Duyne, G. D., Standaert, R. F., Karplus, P. A., Schreiber, S. L., Clardy, J. Atomic structures of the human immunophilin FKBP-12 complexes with FK506 and rapamycin. Journal of Molecular Biology. 229 (1), 105-124 (1993).
- Lomenick, B., Olsen, R. W., Huang, J. Identification of direct protein targets of small molecules. ACS Chemical Biology. 6 (1), 34-46 (2011).
- Park, Y. D., et al. Identification of Multiple Cryptococcal Fungicidal Drug Targets by Combined Gene Dosing and Drug Affinity Responsive Target Stability Screening. MBio. 7 (4), (2016).
- Qu, Y., et al. Small molecule promotes beta-catenin citrullination and inhibits Wnt signaling in cancer. Nature Chemical Biology. 14 (1), 94-101 (2018).
