Полуколичественный препарат affinity Ответственный Целевой стабильности (DARTS) спросить для изучения Rapamycin / mTOR взаимодействия
Summary
В этом исследовании мы расширили возможности анализа данных эксперимента DARTS, отслеживая изменения в стабильности белка и оценивая сродство белково-лигандовых взаимодействий. Взаимодействия могут быть построены на две кривые: протеолитическая кривая и кривая доза-зависимости. Мы использовали mTOR-rapamycin взаимодействия в качестве образцового случая.
Abstract
Препарат Affinity Responsive Target Stability (DARTS) является надежным методом обнаружения новых малых целей белка молекулы. Он может быть использован для проверки известных небольших молекулно-белковых взаимодействий и для поиска потенциальных целей белка для натуральных продуктов. По сравнению с другими методами, DARTS использует родные, неизмененные, маленькие молекулы и прост и прост в эксплуатации. В этом исследовании мы еще больше расширили возможности анализа данных эксперимента DARTS, отслеживая изменения в стабильности белка и оценивая сродство белково-лигандовых взаимодействий. Взаимодействия белково-лигандов могут быть построены на две кривые: протеолитическая кривая и кривая доза-зависимости. Мы использовали взаимодействие mTOR-rapamycin в качестве образцового аргумента для создания нашего протокола. Из протеолитической кривой мы увидели, что протеолиз mTOR pronase тормозится наличием рапамицина. Кривая доза-зависимость позволила оценить связывающее сродство рапамицина и mTOR. Этот метод, вероятно, будет мощным и простым методом для точного определения новых целевых белков и для оптимизации целевого взаимодействия с наркотиками.
Introduction
Выявление малых молекул целевых белков имеет важное значение длямеханистического понимания и развития потенциальных терапевтических препаратов 1,2,3. Хроматография сродства, как классический метод определения целевых белков малых молекул, дала хорошие результаты4,5. Однако, этот метод имеет ограничения, в том, что химическая модификация малых молекул часто приводит к снижению или измененной связывания специфичности или сродства. Для преодоления этих ограничений недавно было разработано и применено несколько новых стратегий для выявления малых молекулных целей без химической модификации малых молекул. Эти прямые методы для целевой идентификации этикетки свободных малых молекул включают препарат сродство реагировать целевой стабильности (DARTS)6, стабильность белков от ставок окисления (SPROX)7, клеточный тепловой анализ (CETSA)8 ,9, и теплового протеома профилирования (TPP)10. Эти методы являются весьма выгодными, поскольку они используют природные, неизмененные небольшие молекулы и полагаться только на прямые связывающие взаимодействия, чтобы найти целевые белки11.
Среди этих новых методов, DARTS является сравнительно простой методологии, которая может быть легко принята в большинстве лабораторий12,13. DARTS зависит от концепции, что лиганд-связанных белков продемонстрировать модифицированную восприимчивость к ферментативной деградации по отношению к несвязанных белков. Новый целевой белок может быть обнаружен путем изучения измененной полосы в геле SDS-PAGE с помощью жидкой хроматографии-масс-спектрометрии (LC-MS/MS). Этот подход был успешно реализован для выявления ранее неизвестных целей натуральных продуктов и лекарств14,15,16,17,18, 19. Он также является мощным в качестве средства для проверки или проверки связывания соединений с конкретным белком20,21. В этом исследовании мы представляем улучшение эксперимента путем мониторинга изменений в стабильности белка с небольшими молекулами и выявления белка-лиганд связывания сходства. Мы используем mTOR-rapamycin взаимодействия в качестве примера, чтобы продемонстрировать наш подход.
Protocol
Representative Results
Discussion
DARTS позволяет идентифицировать небольшие молекулы целей, используя защитный эффект связывания белка против деградации. DARTS не требует каких-либо химических модификаций или иммобилизации небольшой молекулы26. Это позволяет использовать небольшие молекулы для определения …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана NIH научно-исследовательских грантов R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484, а также ДОР научно-исследовательский грант W81XWH-16-1-0482.
Materials
| 100X Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | Dilute to 20X with ultrapure water |
| 293T cell line | ATCC | CRL-3216 | DMEM medium with 10% FBS |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cell scraper | Thermo Fisher | 179693 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution | Bio-Rad | 1610436 | |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 6.0 | statistical analysis and drawing software |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52 | image processing and analysis software |
| M-PER Cell Lysis Reagent | Thermo Fisher | 78501 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | R21-040-CV | |
| Pronase | Roche | PRON-RO | 10 mg/ml |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | 221368 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | adjust to pH 8.0 |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |
References
- Rask-Andersen, M., Masuram, S., Schioth, H. B. The druggable genome: Evaluation of drug targets in clinical trials suggests major shifts in molecular class and indication. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 9-26 (2014).
- O’Connor, C. J., Laraia, L., Spring, D. R. Chemical genetics. Chemical Society Reviews. 40 (8), 4332-4345 (2011).
- McFedries, A., Schwaid, A., Saghatelian, A. Methods for the elucidation of protein-small molecule interactions. Chemistry & Biology. 20 (5), 667-673 (2013).
- Sato, S., Murata, A., Shirakawa, T., Uesugi, M. Biochemical target isolation for novices: affinity-based strategies. Chemistry & Biology. 17 (6), 616-623 (2010).
- Sleno, L., Emili, A. Proteomic methods for drug target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 12 (1), 46-54 (2008).
- Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).
- Strickland, E. C., et al. Thermodynamic analysis of protein-ligand binding interactions in complex biological mixtures using the stability of proteins from rates of oxidation. Nature Protocols. 8 (1), 148-161 (2013).
- Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Savitski, M. M., et al. Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome. Science. 346 (6205), 1255784 (2014).
- Chang, J., Kim, Y., Kwon, H. J. Advances in identification and validation of protein targets of natural products without chemical modification. Natural Product Reports. 33 (5), 719-730 (2016).
- Pai, M. Y., et al. Drug affinity responsive target stability (DARTS) for small-molecule target identification. Methods in Molecular Biology. 1263, 287-298 (2015).
- Lomenick, B., Jung, G., Wohlschlegel, J. A., Huang, J. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 163-180 (2011).
- Xu, L., et al. Precision therapeutic targeting of human cancer cell motility. Nature Communications. 9 (1), 2454 (2018).
- Lim, H., et al. A novel autophagy enhancer as a therapeutic agent against metabolic syndrome and diabetes. Nature Communications. 9 (1), 1438 (2018).
- Schulte, M. L., et al. Pharmacological blockade of ASCT2-dependent glutamine transport leads to antitumor efficacy in preclinical models. Nature Medicine. 24 (2), 194-202 (2018).
- Skrott, Z., et al. Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer via p97 segregase adaptor NPL4. Nature. 552 (7684), 194-199 (2017).
- Zhang, C., et al. Endosidin2 targets conserved exocyst complex subunit EXO70 to inhibit exocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 41-50 (2016).
- Chin, R. M., et al. The metabolite alpha-ketoglutarate extends lifespan by inhibiting ATP synthase and TOR. Nature. 510 (7505), 397-401 (2014).
- Robinson, T. J., et al. High-throughput screen identifies disulfiram as a potential therapeutic for triple-negative breast cancer cells: interaction with IQ motif-containing factors. Cell Cycle. 12 (18), 3013-3024 (2013).
- Aghajan, M., et al. Chemical genetics screen for enhancers of rapamycin identifies a specific inhibitor of an SCF family E3 ubiquitin ligase. Nature Biotechnology. 28 (7), 738-742 (2010).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
- Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
- Van Duyne, G. D., Standaert, R. F., Karplus, P. A., Schreiber, S. L., Clardy, J. Atomic structures of the human immunophilin FKBP-12 complexes with FK506 and rapamycin. Journal of Molecular Biology. 229 (1), 105-124 (1993).
- Lomenick, B., Olsen, R. W., Huang, J. Identification of direct protein targets of small molecules. ACS Chemical Biology. 6 (1), 34-46 (2011).
- Park, Y. D., et al. Identification of Multiple Cryptococcal Fungicidal Drug Targets by Combined Gene Dosing and Drug Affinity Responsive Target Stability Screening. MBio. 7 (4), (2016).
- Qu, Y., et al. Small molecule promotes beta-catenin citrullination and inhibits Wnt signaling in cancer. Nature Chemical Biology. 14 (1), 94-101 (2018).
