Een semi-kwantitatieve drug affiniteit responsieve doel stabiliteit (DARTS) assay voor het bestuderen van Rapamycine/mTOR interactie
Summary
In deze studie hebben we de mogelijkheden voor gegevensanalyse van het DARTS experiment verbeterd door de veranderingen in de eiwit stabiliteit te monitoren en de affiniteit van eiwit-ligand interacties te schatten. De interacties kunnen in twee krommen worden uitgezet: een Proteolytische curve en een Dosisafhankelijkheid. We hebben mTOR-rapamycine interactie gebruikt als een voorbeeldige zaak.
Abstract
Drug Affinity responsieve doel stabiliteit (DARTS) is een robuuste methode voor de detectie van nieuwe kleine molecuul eiwit targets. Het kan worden gebruikt om bekende kleine molecuul-eiwit interacties te controleren en om potentiële eiwit doelen voor natuurlijke producten te vinden. In vergelijking met andere methodes gebruikt DARTS native, ongewijzigde, kleine moleculen en is eenvoudig en eenvoudig te bedienen. In deze studie hebben we de mogelijkheden voor gegevensanalyse van het DARTS experiment verder verbeterd door de veranderingen in de eiwit stabiliteit te monitoren en de affiniteit van eiwit-ligand interacties te schatten. De eiwit-ligand interacties kunnen in twee krommen worden uitgezet: een Proteolytische curve en een dosis-afhankings curve. We hebben de interactie mTOR-rapamycine gebruikt als een voorbeeldige Case voor de totstandkoming van ons protocol. Uit de Proteolytische curve zagen we dat de proteolyse van mTOR door pronase werd geremd door de aanwezigheid van rapamycine. De dosis-afhankelijkheids curve stelde ons in staat om de bindingsaffiniteit van rapamycine en mTOR te schatten. Deze methode is waarschijnlijk een krachtige en eenvoudige methode voor het nauwkeurig identificeren van nieuwe doel eiwitten en voor de optimalisatie van de betrokkenheid van het doel van de drug.
Introduction
Identificeren van kleine molecule doelwit eiwitten is essentieel voor het mechanistische begrip en de ontwikkeling van potentiële therapeutische geneesmiddelen1,2,3. Affiniteits chromatografie, als een klassieke methode voor het identificeren van de doel eiwitten van kleine moleculen, heeft goede resultaten opgeleverd4,5. Echter, deze methode heeft beperkingen, in die chemische modificatie van kleine moleculen resulteert vaak in verminderde of veranderde bindende specificiteit of affiniteit. Om deze beperkingen te overwinnen, zijn onlangs verschillende nieuwe strategieën ontwikkeld en toegepast om de kleine molecuul doelen te identificeren zonder chemische modificatie van de kleine moleculen. Deze directe methoden voor de identificatie van het label vrij kleine moleculen omvatten responsieve doel stabiliteit (DARTS)6, stabiliteit van eiwitten uit oxidatiemiddelen (sprox)7, cellulaire thermische verschuiving assay (cetsa)8 ,9, en thermische Proteoom profilering (TPP)10. Deze methoden zijn zeer voordelig omdat ze natuurlijke, ongewijzigde kleine moleculen gebruiken en alleen op directe bindende interacties vertrouwen om doel eiwitten11te vinden.
Onder deze nieuwe methoden, darts is een relatief eenvoudige methodologie die gemakkelijk kan worden overgenomen door de meeste Labs12,13. DARTS is afhankelijk van het concept dat ligand-gebonden eiwitten een gemodificeerde gevoeligheid voor enzymatische afbraak ten opzichte van ongebonden eiwitten aantonen. Het nieuwe doeleiwit kan worden gedetecteerd door onderzoek van de veranderde band in SDS-PAGE gel door middel van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS/MS). Deze aanpak is met succes geïmplementeerd voor de identificatie van eerder onbekende doelwitten van natuurlijke producten en geneesmiddelen14,15,16,17,18, 19. het is ook krachtig als middel om te schermen of te valideren binding van verbindingen met een specifiek eiwit20,21. In deze studie presenteren we een verbetering van het experiment door het monitoren van de veranderingen in de eiwit stabiliteit met kleine moleculen en het identificeren van eiwit-ligand bindende verwantschappen. We gebruiken mTOR-rapamycine interactie als voorbeeld om onze aanpak te demonstreren.
Protocol
Representative Results
Discussion
DARTS maakt het mogelijk om kleine molecuul doelen te identificeren door het beschermende effect van eiwitbinding tegen afbraak te benutten. DARTS vereist geen chemische modificatie of immobilisatie van het kleine molecuul26. Hierdoor kunnen kleine moleculen worden gebruikt om hun directe bindende eiwit doelen te bepalen. Standaard beoordelingscriteria voor de klassieke Darts methode zijn onder meer gelkleuring, massaspectrometrie en Western blotting12,<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd deels gesteund door NIH Research Grants R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484, en een DOD Research Grant W81XWH-16-1-0482.
Materials
| 100X Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | Dilute to 20X with ultrapure water |
| 293T cell line | ATCC | CRL-3216 | DMEM medium with 10% FBS |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cell scraper | Thermo Fisher | 179693 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution | Bio-Rad | 1610436 | |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 6.0 | statistical analysis and drawing software |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52 | image processing and analysis software |
| M-PER Cell Lysis Reagent | Thermo Fisher | 78501 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | R21-040-CV | |
| Pronase | Roche | PRON-RO | 10 mg/ml |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | 221368 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | adjust to pH 8.0 |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |
References
- Rask-Andersen, M., Masuram, S., Schioth, H. B. The druggable genome: Evaluation of drug targets in clinical trials suggests major shifts in molecular class and indication. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 9-26 (2014).
- O’Connor, C. J., Laraia, L., Spring, D. R. Chemical genetics. Chemical Society Reviews. 40 (8), 4332-4345 (2011).
- McFedries, A., Schwaid, A., Saghatelian, A. Methods for the elucidation of protein-small molecule interactions. Chemistry & Biology. 20 (5), 667-673 (2013).
- Sato, S., Murata, A., Shirakawa, T., Uesugi, M. Biochemical target isolation for novices: affinity-based strategies. Chemistry & Biology. 17 (6), 616-623 (2010).
- Sleno, L., Emili, A. Proteomic methods for drug target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 12 (1), 46-54 (2008).
- Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).
- Strickland, E. C., et al. Thermodynamic analysis of protein-ligand binding interactions in complex biological mixtures using the stability of proteins from rates of oxidation. Nature Protocols. 8 (1), 148-161 (2013).
- Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Savitski, M. M., et al. Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome. Science. 346 (6205), 1255784 (2014).
- Chang, J., Kim, Y., Kwon, H. J. Advances in identification and validation of protein targets of natural products without chemical modification. Natural Product Reports. 33 (5), 719-730 (2016).
- Pai, M. Y., et al. Drug affinity responsive target stability (DARTS) for small-molecule target identification. Methods in Molecular Biology. 1263, 287-298 (2015).
- Lomenick, B., Jung, G., Wohlschlegel, J. A., Huang, J. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 163-180 (2011).
- Xu, L., et al. Precision therapeutic targeting of human cancer cell motility. Nature Communications. 9 (1), 2454 (2018).
- Lim, H., et al. A novel autophagy enhancer as a therapeutic agent against metabolic syndrome and diabetes. Nature Communications. 9 (1), 1438 (2018).
- Schulte, M. L., et al. Pharmacological blockade of ASCT2-dependent glutamine transport leads to antitumor efficacy in preclinical models. Nature Medicine. 24 (2), 194-202 (2018).
- Skrott, Z., et al. Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer via p97 segregase adaptor NPL4. Nature. 552 (7684), 194-199 (2017).
- Zhang, C., et al. Endosidin2 targets conserved exocyst complex subunit EXO70 to inhibit exocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 41-50 (2016).
- Chin, R. M., et al. The metabolite alpha-ketoglutarate extends lifespan by inhibiting ATP synthase and TOR. Nature. 510 (7505), 397-401 (2014).
- Robinson, T. J., et al. High-throughput screen identifies disulfiram as a potential therapeutic for triple-negative breast cancer cells: interaction with IQ motif-containing factors. Cell Cycle. 12 (18), 3013-3024 (2013).
- Aghajan, M., et al. Chemical genetics screen for enhancers of rapamycin identifies a specific inhibitor of an SCF family E3 ubiquitin ligase. Nature Biotechnology. 28 (7), 738-742 (2010).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
- Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
- Van Duyne, G. D., Standaert, R. F., Karplus, P. A., Schreiber, S. L., Clardy, J. Atomic structures of the human immunophilin FKBP-12 complexes with FK506 and rapamycin. Journal of Molecular Biology. 229 (1), 105-124 (1993).
- Lomenick, B., Olsen, R. W., Huang, J. Identification of direct protein targets of small molecules. ACS Chemical Biology. 6 (1), 34-46 (2011).
- Park, Y. D., et al. Identification of Multiple Cryptococcal Fungicidal Drug Targets by Combined Gene Dosing and Drug Affinity Responsive Target Stability Screening. MBio. 7 (4), (2016).
- Qu, Y., et al. Small molecule promotes beta-catenin citrullination and inhibits Wnt signaling in cancer. Nature Chemical Biology. 14 (1), 94-101 (2018).
