Movimento shootward di CFDA Tracer caricato nei tessuti lavello inferiore di Arabidopsis

Molti traccianti fluorescenti con una gamma di proprietà spettrali, come 5 (6)-carbossilfluoreina (CF) 1,8-idrossipirene-1, 3, 6-acido trisolfonico², Lucifero giallo ch (Lych)³, esculin e CTER⁴, sono stati sviluppati e applicato nelle piante per monitorare il movimento simplastico e l’attività floema. Generalmente, un colorante simplastico viene caricato in un taglio nel tessuto bersaglio e la dispersione sequenziale del reporter in altre parti dell’impianto dimostrerà la comunicazione intercellulare. Anche se il meccanismo di assorbimento del colorante non è pienamente compreso, il principio sottostante movimento CF all’interno di cellule vive è stato ampiamente riconosciuto. La forma di estere di CF (diacetato CF, CFDA) è non fluorescente, ma permeabile alla membrana. Questa proprietà consente una rapida diffusione della membrana del colorante nelle cellule. Una volta all’interno delle cellule vive, le esterasi intracellulari rimuovono i gruppi di acetato alla posizione 3′ e 6′ di CFDA, rilasciando la CF fluorescente e impermeabile alla membrana (Figura 1, in alternativa, fare riferimento a Wright et al.²); CF può quindi muoversi attraverso il plasmodesmi ad altre parti di piante.

Una procedura consolidata con CFDA è che può essere caricata in foglie di origine e utilizzata per monitorare lo streaming floema e lo scarico floema nei tessuti lavello di molte specie, ad esempio, come scarico CF nella radice di Arabidopsis ⁵, scarico floema durante la tuberizzazione di patate⁶, scarico floema nel lavello Nicotiana lascia⁷, e così via. Con approcci di carico simili, altri studi hanno adottato questo colorante per dimostrare la connessione simplastico tra host e parassita^8,9, o per rivelare le relazioni simbiotiche^10,11.

Un altro modo per fare uso di questo colorante è quello di caricarlo in cellule specifiche o singola cellula mediante microiniezione per determinare il suo modello di distribuzione. Tali tecniche sofisticate hanno notevolmente facilitato la nostra più profonda comprensione della comunicazione intercellulare mediata da plasmodesmato, in particolare nello sviluppo del concetto di dominio simplastico^12,13. Ad esempio, la microiniezione di CFDA in cellule di cotilina di Arabidopsis ha provocato il modello di accoppiamento colorante nell’epidermide ipocotilica ma non accoppiamento nelle cellule sottostanti o nell’epidermide radice, pertanto l’epidermide ipocotilica forma un dominio simplastico¹⁴. Domini simili, come le cellule di guardia stomatale¹⁵, elemento setaccio-cellule compagno¹⁶, cellule dei capelli di radice¹⁴ e tappo di radice^17,18 sono stati identificati con la tecnica di microiniezione. Sorprendentemente, alcuni domini consentono alle molecole traccianti di muoversi in una certa direzione. Prendete il dominio Tricomi, ad esempio, la microiniezione di una sonda fluorescente nella cellula epidermica di supporto conduce al flusso di tracciante nel dominio Tricomi, tuttavia, l’iniezione inversa non tiene vero¹⁹. Un recente rapporto ha anche trovato situazioni simili nei domini simplastico dell’embrione Sedum ²⁰. Così, tutti i casi di cui sopra implicano che lo scambio di siti di carico può portare a nuove intuizioni sulla comunicazione simplastico. Il nostro esperimento precedente con l’obiettivo di sezionare il percorso di silenziamento mobile root-to-Shoot ha identificato un nuovo dominio simplastico, o la zona di Hej (igenici-epicotil), che è stata ulteriormente verificata attraverso la CFDA carico di radice (non canonica) esperimento²¹. Qui, abbiamo ulteriormente elaborato il movimento CF Root-to-Shoot utilizzando un metodo semplice e recuperare un potenziale dominio simplastico spostando i siti di carico. Inoltre, questa procedura può essere adattata per differenziare gli sfondi genetici che hanno alterato il trasporto a lunga distanza da root a sparare.