حركه إطلاق النار من الراسم CFDA المحملة في الانسجه بالوعة القاع من Arabidopsis
Summary
الهدف من هذا البروتوكول هو إظهار كيفيه تحميل CFDA إلى مواقع مختلفه من الأجزاء السفلية من Arabidopsis. ثم نقدم نمط التوزيع الناتج من CF في البراعم.
Abstract
وقد تم تطبيق الراسم symplastic 5 (6)-كاربوكسيفلوريسسين دياسيتات (cfda) علي نطاق واسع في النباتات الحية لإثبات الاتصال بين الخلوية ، لحاء النقل والاوعيه الدموية زخرفه. يظهر هذا البروتوكول حركه كاربوكسيفلوريسسين (CF) من أسفل إلى اعلي في Arabidopsis باستخدام قطع الجذر والاجراء سويق-معسر علي التوالي. ينتج هذا اثنان إجراءات مختلفه في فعاليه مختلفه من [سف] حركه: حوالي 91% مظهر من [سف] في اليقذف مع ال [سويق-معسر] اجراء, حيث ان فقط حوالي 70% مظهر من [سف] مع ال [رو-بتر] اجراء. تغيير بسيط من مواقع التحميل ، مما ادي إلى تغييرات كبيره في كفاءه المحمول من هذه الصبغة symplastic ، يوحي حركه CF قد تكون خاضعه للتنظيم symplastic ، علي الأرجح من قبل تقاطع سويق الجذر.
Introduction
العديد من القصبات الفلورية مع مجموعه من الخصائص الطيفية ، مثل 5 (6)-كاربوكسيفلوريسسين (CF)1، 8-هيدروكسي برينيه-1 ، 3 ، 6-ثلاثي الفوسفات حمض2، إبليس الأصفر CH (lych)3، esculin و cter4، وقد وضعت و تطبيقها في النباتات لمراقبه حركه symplastic والنشاط لحاء. عموما ، يتم تحميل صبغه symplastic إلى قطع في الانسجه المستهدفة والتشتت متسلسلة من مراسل في أجزاء أخرى من النبات سوف تظهر الاتصالات بين الخلايا. علي الرغم من ان اليه امتصاص الصبغة غير مفهومه تماما ، فقد تم الاعتراف علي نطاق واسع بالمبدا الكامن وراء حركه CF داخل الخلايا الحية. شكل استر من CF (CF diacetate ، CFDA) غير فلوري ، ولكن غشاء نفاذيه. يسمح هذا خاصيه انتشار سريعة غشاء من الصبغ داخل خلايا. مره واحده داخل الخلايا الحية ، استراسيس في الخلايا أزاله مجموعات خلات في 3 ‘ و 6 ‘ موقف CFDA ، والإفراج عن CF وغشاء-غير نفاذه (الشكل 1، بدلا من ذلك الرجوع رايت وآخرون2) ؛ CF يمكن بعد ذلك التحرك من خلال الهيوليه إلى أجزاء أخرى من النباتات.
وهناك اجراء راسخ مع cfda هو انه يمكن تحميله في أوراق المصدر وتستخدم لمراقبه تدفق لحاء و لحاء تفريغ في الانسجه بالوعة من العديد من الأنواع ، علي سبيل المثال ، كما CF التفريغ في Arabidopsis الجذر5، لحاء تفريغ خلال البطاطا الدرني6، لحاء تفريغ في بالوعة نيكوتيانا يترك7، وهلم جرا. من خلال نهج التحميل مماثله ، اعتمدت دراسات أخرى هذه الصبغة لإثبات الاتصال symplastic بين المضيف والطفيلي8،9، أو للكشف عن العلاقات التكافلية10،11.
طريقه أخرى للاستفادة من هذه الصبغة هي لتحميلها في خلايا معينه أو خليه واحده عن طريق الحقن المجهري لتحديد نمط التوزيع الخاص به. وقد سهلت هذه التقنيات المتطورة إلى حد كبير فهمنا أعمق من الاتصالات الخلوية بوساطة plasmodesmata, لا سيما في تطوير مفهوم المجال symplastic12,13. علي سبيل المثال, الحقن المجهري لل cfda في الخلايا كوتيليدون من Arabidopsis أسفرت عن نمط اقتران صبغ في البشرة السويقه ولكن غير اقتران في الخلايا الاساسيه أو في البشرة الجذر, التالي فان البشرة السويقه تشكل symplastic المجال14. المجالات المماثلة ، مثل الخلايا الحرس المعدة15، غربال عنصر-رفيق الخلايا16، وخلايا الشعر الجذر14 والجذر كاب17، وقدتم تحديد18 من قبل تقنيه الحقن المجهري. والأكثر دهشة ان بعض المجالات تسمح لجزيئات التتبع بالتحرك في اتجاه معين. اتخاذ المجال [تريشم] علي سبيل المثال ، الحقن المجهري لمسبار الفلورسنت في خليه دعم البشرة يؤدي إلى تدفق المقتفي في مجال [تريشم] ، ومع ذلك ، لا يحمل الحقن العكسي صحيح19. وقد وجد تقرير صدر مؤخرا أيضا حالات مماثله في المجالات symplastic من الجنين Sedum 20. التالي ، فان جميع الحالات المذكورة أعلاه تعني ان مبادله مواقع التحميل قد تؤدي إلى رؤى جديده في الاتصالات البلاستيكية. تجربتنا السابقة تهدف إلى تشريح الطريق من الجذر إلى تبادل لإطلاق النار المحمول إسكات التعرف علي المجال الجديد symplastic ، أو HEJ (تقاطع سويق-ابيتوسيل) ، والتي تم التحقق كذلك من خلال تحميل الجذر (غير المتعارف عليها بالوعة التحميل) CFDA تجربه21. هنا ، ونحن أيضا وضع الجذر إلى تبادل لإطلاق النار CF الحركة باستخدام طريقه بسيطه واستعاده مجال symplastic المحتملة عن طريق تحويل مواقع التحميل. وعلاوة علي ذلك ، يمكن تكييف هذا الاجراء للتمييز بين الخلفيات الوراثية التي غيرت النقل البري البري إلى التصوير لمسافات طويلة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أظهرت الدراسات الناشئة ان النباتات يمكن ان تستجيب بسرعة للمؤثرات الخارجية23، بما في ذلك التلاعب التي أدخلت علي الإجراءات التجريبية22. في تجربتنا الاوليه ، غالبا ما تؤدي مراقبتنا لهذه المعرفة إلى تلطيخ الفشل. مع هذه الدروس ، ونحن نقترح ان توضع في الاعتبار الاحت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31671257) ومركز هوبي للابتكار التعاوني لصناعه الحبوب (LXT-16-18).
Materials
| KNO3 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017218 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | |
| MgSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10013018 | |
| CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 20011160 | |
| MnSO4·H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10013418 | |
| Na2MoO4·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10019818 | |
| Boric Acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | |
| ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10024018 | |
| CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10008218 | |
| CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10007216 | |
| KI | Sinopharm Chemical Reagent | 10017160 | |
| FeSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10012118 | |
| EDTA | Sinopharm Chemical Reagent | 10009717 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| KOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10017018 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent | 10021418 | |
| Myo-inositol | MACKLIN | I811835 | |
| Nicotinic Acid | MACKLIN | N814565 | |
| Pyridoxine HCl | MACKLIN | V820447 | |
| Thiamine HCl | MACKLIN | T818865 | |
| Glycine | MACKLIN | G800880 | |
| Agar powder | Novon | ZZ14022 | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axio Zoom V16 | |
| Dissecting microscope | SDPTOP | SRE-1030 | |
| 200μl pipette | Dragon Laboratory Instruments | 713111110000-20-200ul | |
| 2.5μl pipette | Eppendorf | 3120000011 | |
| Fine forceps | TWEEZERS | ST-15 | |
| Parafilm | PARAFILM | PM-996 | |
| Stainless steel double-sided blade | Gillette | Platinum-Plus Double-Edge Blade | |
References
- Grignon, N., Touraine, B., Durand, M. 6(5)Carboxyfluorescein as a tracer of phloem sap translocation. American Journal of Botany. 76, 871-877 (1989).
- Wright, K. M., Oparka, K. J. The fluorescent probe HPTS as a phloem-mobile, symplastic tracer: an evaluation using confocal laser scanning microscopy. Journal of Experimental Botany. 47 (3), 439-445 (1996).
- Oparka, K. J., Prior, D. A. Movement of Lucifer Yellow CH in potato tuber storage tissues: A comparison of symplastic and apoplastic transport. Planta. 176 (4), 533-540 (1988).
- Knoblauch, M., et al. Multispectral Phloem-Mobile Probes: Properties and Applications. Plant Physiology. 167 (4), 1211-1220 (2015).
- Oparka, K. J., Duckett, C. M., Prior, D. A. M., Fisher, D. B. Real-time imaging of phloem unloading in the root tip of Arabidopsis. The Plant Journal. 6 (5), 759-766 (1994).
- Viola, R., et al. Tuberization in Potato Involves a Switch from Apoplastic to Symplastic Phloem Unloading. The Plant Cell. 13 (2), 385-398 (2001).
- Roberts, A. G., et al. Phloem Unloading in Sink Leaves of Nicotiana benthamiana: Comparison of a Fluorescent Solute with a Fluorescent Virus. The Plant Cell. 9 (8), 1381-1396 (1997).
- Péron, T., et al. New Insights into Phloem Unloading and Expression of Sucrose Transporters in Vegetative Sinks of the Parasitic Plant Phelipanche ramosa L (Pomel). Frontiers in Plant Science. 7 (2048), (2017).
- Spallek, T., et al. Interspecies hormonal control of host root morphology by parasitic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (20), 5283-5288 (2017).
- Complainville, A., et al. Nodule initiation involves the creation of a new symplasmic field in specific root cells of medicago species. The Plant Cell. 15 (12), 2778-2791 (2003).
- Bederska, M., Borucki, W., Znojek, E. Movement of fluorescent dyes Lucifer Yellow (LYCH) and carboxyfluorescein (CF) in Medicago truncatula Gaertn. roots and root nodules. Symbiosis. 58 (1-3), 183-190 (2012).
- Robards, A. W., Lucas, W. J. Plasmodesmata. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 41 (1), 369-419 (1990).
- Roberts, A. G., Oparka, K. J. Plasmodesmata and the control of symplastic transport. Plant, Cell & Environment. 26 (1), 103-124 (2003).
- Duckett, C. M., Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Dolan, L., Roberts, K. Dye-coupling in the root epidermis of Arabidopsis is progressively reduced during development. Development. 120 (11), 3247-3255 (1994).
- Palevitz, B. A., Hepler, P. K. Changes in dye coupling of stomatal cells of Allium and Commelina demonstrated by microinjection of Lucifer yellow. Planta. 164 (4), 473-479 (1985).
- van Bel, A. J. E., Kempers, R. Symplastic isolation of the sieve element-companion cell complex in the phloem of Ricinus communis and Salix alba stems. Planta. 183 (1), 69-76 (1991).
- Erwee, M. G., Goodwin, P. B. Symplast domains in extrastelar tissues of Egeria densa Planch. Planta. 163 (1), 9-19 (1985).
- Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Wright, K. M. Symplastic communication between primary and developing lateral roots of Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 46 (2), 187-197 (1995).
- Christensen, N. M., Faulkner, C., Oparka, K. Evidence for Unidirectional Flow through Plasmodesmata. Plant Physiology. 150 (1), 96-104 (2009).
- Wróbel-Marek, J., Kurczyńska, E., Płachno, B. J., Kozieradzka-Kiszkurno, M. Identification of symplasmic domains in the embryo and seed of Sedum acre L. (Crassulaceae). Planta. 245 (3), 491-505 (2017).
- Liang, D., White, R. G., Waterhouse, P. M. Gene silencing in Arabidopsis spreads from the root to the shoot, through a gating barrier, by template-dependent, non-vascular, cell to cell movement. Plant Physiology. 159 (3), 984-1000 (2012).
- Radford, J. E., White, R. G. Effects of tissue-preparation-induced callose synthesis on estimates of plasmodesma size exclusion limits. Protoplasma. 216 (1-2), 47-55 (2001).
- Kollist, H., et al. Rapid Responses to Abiotic Stress: Priming the Landscape for the Signal Transduction Network. Trends in Plant Science. 24 (1), 25-37 (2019).
- Haupt, S., Duncan, G. H., Holzberg, S., Oparka, K. J. Evidence for Symplastic Phloem Unloading in Sink Leaves of Barley. Plant Physiology. 125 (1), 209-218 (2001).
- Botha, C. E. J., et al. A xylem sap retrieval pathway in rice leaf blades: evidence of a role for endocytosis?. Journal of Experimental Botany. 59 (11), 2945-2954 (2008).
