JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

In vivo serebral mikrodiyaliz ile kuvvet ve rotasyonu birleştiren bir yeni ve translasyonel rat modeli

Published: July 12, 2019
doi:
10.3791/59585
, , , , ,
1Research Center,Hôpital du Sacré-Cœur de Montréal, 2Research Center,Douglas Institute

Summary

Nörotransmitter değişimi, beyin sarsıntısı sonrası meydana gelen ve bazen-felaket uzun vadeli sonuçlara katkı sağlayan bir nöral fonksiyon bozukluğu mekanizmasıdır. Bu sıçan modeli, insan kraniyoerebral travmanın önemli bir faktörü olan baş ve gövdedeki hızlı hızlanma ve yavaşlama sağlayan bir ağırlık düşürme tekniği ile, in vivo nörotransmitter quantification ile mikrodiyalizi birleştirir.

Abstract

Kalıcı bilişsel ve motor belirtileri concussions sonuçları bilinmektedir/hafif travmatik beyin hasarı (mTBIs) kısmen değiştirilmiş nörotransmisyon olabilir. Gerçekten de, kemirgenlerde serebral mikrodiyaliz çalışmaları, travmanın ardından ilk 10 dakika içinde hipokampus içinde aşırı bir ekstrasellüler glutamat salınımı göstermiştir. Mikrodiyaliz, hayvanı feda etmek zorunda değilken in vivo nörotransmitter sürekli örneklemesinin net bir avantajı sunar. Söz konusu tekniğin yanı sıra, baş ve gövdedeki hızlı ivme ve yavaşlama sağlayan kapalı bir baş yaralanma modeli, bu tür bir faktör birçok hayvan modelinde mevcut olmadığı için gereklidir. Wayne State ağırlık düşürme modeli, insan kraniyokerebral travmanın bu temel bileşenini taklit eder ve düşen bir ağırlığa sahip bir düzensiz kemirgen kafası üzerinde bir etkiye olanak sağlar. Bizim roman ve translasyonel sıçan modeli, hafif anestezikli ve kısıtlaştırılmış yetişkin fareler, sarsıntıdan sonra ekstrasellüler nörotransmitter düzeylerinde akut değişiklikler, çalışmak için Wayne State Ağırlık bırakma modeli ile serebral mikrodiyaliz birleştirir. Bu protokolde, mikrodiyaliz sondası Hippocampus içine ilgi bölgesi olarak yerleştirildi ve darbe sırasında beyne takılı bırakılmıştı. Hippocampus terminaller ve reseptörleri yüksek yoğunluklu, beyin sarsıntısı aşağıdaki değiştirilmiş nörotransmisyon belge için ilgili bir bölge yapma. Yetişkin Sprague-Dawley fareler uygulandığında, ilk 10 dakika içinde hipokampal ekstrellüler glutamat konsantrasyonlarda kombine model indüklenen artar, daha önce bildirilen sarsıntı sonrası semptomatik ile tutarlı. Bu kombine Ağırlık bırakma modeli, araştırmacılar için tekrarlayan beyin yaralanmasına ek olarak beyin sarsıntısı erken terapötik tepkiler çalışması için güvenilir bir araç sağlar, bu protokol bir kapalı kafa hafif travma indükler beri.

Introduction

Bu yöntemin amacı, araştırmacıların insan kraniyokerebral travmanın biyomektiklerini, concussions/hafif travmatik beynin moleküler etkilerinin boyuna karakterize etmesine izin verirken, güvenilir bir araç ile sağlamaktır. hasar (mTBIs). Bu yöntem, beyin mikro diyaliz ile Wayne State ağırlık düşürme modeli ile birleştirir, hafifçe anesteziyle ve kısıtlaştırılmış yetişkin fareler, beyin sarsıntısı sonrasında ekstrasellüler nörotransmitter düzeylerinde akut değişiklikler. Bu Minimally-invaziv yöntemi ile, glutamat gibi nörotransmitter, GABA, taurin, gcine ve serin hızla ve sürekli travma aşağıdaki nicelleşmiş olabilir, in vivo, hayvan feda etmek zorunda değilken.

Sarsıntı/Mtbı bir dış kuvvet mekanizması nedeniyle beyin işleyişini etkileyen bir patofizyolojik bozulma olduğunu. Sarsıntı/Mtbı travmatik beyin hasarı en yaygın biçimidir,% 70-90 için muhasebe olguların1. Bir sarsıntının ardından akut fonksiyonel kesintilerin çoğu primer ve ikincil beyin yaralanması2,3ile ilişkilendirilebilir: (1) primer beyin hasarı, baş ve gövdedeki hızlı hızlanma ve yavaşlama ile indüklenir. Hangi hasar beyin dokularında basınç tarafından takip germe ve aksonlar kesme sırasında4,5,6 ve (2) ikincil beyin hasarı travma dolaylı hücresel yanıt olduğunu. Birincil beyin yaralanmasından saat ve gün sonra gerçekleşir ve zaman içinde gözlenen motor ve bilişsel bozukluğu önemli bir rol oynamaktadır. Semptomların çoğu, ilk 10 dakika sonra yaralanma7,8,9‘ da daha önce gösterilen aşırı ekstrenüler glutamat salınımı gibi değiştirilmiş nörotransmisyon ile ilişkilendirilebilir. Terminaller ve reseptörlerin yüksek yoğunluğuna göz önüne alındığında, hipokampus yaralanma sonrasında özellikle bu uyarıotoksisik tepki için savunmasız bir beyin yapısıdır. Şiddetli bilişsel fonksiyon10,11, kemirgenler çalışmalar dahil olmak sarsıntı ile ilgili hipokampal hasar korku klima ve öğrenme uzamsal bellek bozuklukları neden olabilir rapor12 , 13. bu metodolojinin birincil amacı, bir sıçan modeli sarsıntı/Mtbı, Wayne devlet kapalı baş ağırlık-Drop prosedürü sadakatle birincil beyin hasarı mekanizmaları çoğaltmak ve serebral dahil kullanarak çalışmak oldu mikrodiyaliz içinde vivo çalışma, akut ekstrselüler nörotransmitter bir sarsıntı sonrasında ikincil beyin yaralanması nedeniyle değişir. Hippocampus yöntemimizin temsili sonuçlar olarak hareket etmek için ekstrelüler glutamat ve GABA konsantrasyonları ölçülmüştür.

Önceki kemirgen çalışmalar kombine mikrodiyaliz ve diğer yaralanma modelleri, Açık kafatası ağırlığı düşüş ve kontrollü kortikal etkisi gibi, değişen şiddeti bir yaralanma aşağıdaki ekstrellüler nörotransmitter düzeylerinde akut değişiklikleri göstermek için derece14,15,16,17. Ancak, değişkenlik yüksek derecelere ek olarak, Açık kafatası ağırlığı düşüş ve kontrollü kortikal etkisi gibi modellerin translasyonel değeri 2 faktörler nedeniyle ekolojik geçerlilik doğal eksikliği ile engelleniyor: (1) bu modeller çok yaralanmalara neden insanların muzdarip sporlarla ilgili sarsıntı daha şiddetli, doğrudan beyin yükleme içeren ve (2) bu modeller bir Kraniyektomi veya kraniyotomi gerektirmek, kemirgen kafası tamamen bir stereotaktik çerçevede kısıtlayan, hızlı engelleyen ivme ve kafa ve gövde yavaşlama, böylece kötü sarsıntı biyomekanik üreterek.

Mikrodializ, glutamat, GABA, taurin, glisin ve serine, in vivo ve sürekli travma sonrası gibi nörotransmitter örneklemenin net bir avantajı sunan minimal-invazif bir yöntemdir, ancak hayvanı feda etmek zorunda değilken. Mikrodiyaliz tarafından sunulan avantajlara ek olarak, Wayne Devlet Üniversitesi kapalı kafatası ağırlığı-Drop modeli geliştirdi (diğer modellerin açık kafatası aksine), hangi bir Mtbı indüksiyon hafif anestezize ve kısıtsız kemirgen üzerinde sağlar, Böylece baş ve gövde18hızlı ivme ve yavaşlama izin. Daha önce de belirtildiği üzere, baş ve gövdedeki ivme ve yavaşlama, önceki kemirgen Mtbı modellerinin adreslere açılmamış olduğu insanlarda görülen spor ile ilgili sarsıntı unsurların çekirdek biyomekanik özelliğidir. Ağırlık düşürme prosedürü çok hızlı bir şekilde yapılabilir ve önceden ameliyat veya kafa derisi kesi gerektirmez. Sarsıntının ardından, kemirgenler neredeyse kendiliğinden nişan refleks kurtarmak ve tek bir etkisi sonra felç, nöbetler veya solunum sıkıntısı deneyimi yok. İntrakraniyal kanamalar ve kafatası kırıkları nadirdir, ve motor koordinasyonunda sadece küçük açıkları kemirgenler bildirilmiştir. Bu sıçan modeli kullanımı kolay, ucuz ve etkisi sırasında mikrodiyaliz prob çıkarmadan bir sarsıntı aşağıdaki akut aşamada yayımlanan nörotransmitter ölçülmesi kolaylaştırır.

Mikrodiyaliz ve sarsıntı birleştiren sıçan modeli, sarsıntının uzunlamasına moleküler etkilerini karakterize etmek isteyen araştırmacılar için uygundur ve çok çeşitli terapötik çalışmalarda kullanılabilir. Nitekim, araştırma ve ezici bir ihtiyaç birkaç yıl rağmen, hiçbir ilaç beyin sarsıntısı uzun vadeli etkileri önlemek için klinik deneme aşaması geçti19. Bu arızaların olası nedenlerinden biri, insanlar tarafından deneyimli olarak sarsıntılı travmatik biyomekanik güçleri sadakatle çoğaltmak değil hayvan modellerinin kullanımı olabilir. Burada sunulan yöntem, birincil beyin yaralanmasının künt bir etkiye yanı sıra baş ve gövde2,3hızlı hızlanma ve yavaşlama tarafından indüklenen belirtir insan sarsıntısı tanımı karşılar.

Dahası, kombine model, tekrarlayan hafif travmatik beyin hasarı etkileri okuyan araştırmacılar için uygundur (Rmtbı) bu yüzden beyin sarsıntısı diğer hayvan modelleri ayrı ayarlar onun önemli özelliklerinden biri, bunu mümkün kılan olduğunu tekrarlanan, aynı durumda hafif yaralanmalar18. İnsanlarda, rmtbi daha şiddetli post-travmatik belirtiler ile ilişkilidir, uzun iyileşme süreleri, ve zaman içinde yaymak eğilimindedir ağır motor ve bilişsel bozuklukları20,21. Diğer ilgili hayvan modelleri Ayrıca rmtbi ‘nin travma sonrası patofizyolojisi daha iyi anlamanıza olanak sağladı22,23,24,25,26,27 . Artan beyin açığı 24 saat aralıklarla en az 5 Mtbı sonra kemirgenler gösterilmiştir. Mtbı deneyimli ve Nörodejenerasyon belirteçleri sayısı ile nöroinflamasyon artar görünür28. Tekrarlanan Mtbı mikroglia bir proinflamatuar modundan kurtarma normal moduna geçiş önleyecek, uzun süreli izotoksisik aktivite ve nörodejeneratif mekanizmaları aktivasyonu sonuçlanan 29. Modelimiz ile, fareler toplam 5 pozlama için 1 hafta boyunca günde 1 etkisi maruz olabilir. Bu hayvan modelinin basitliği göz önüne alındığında, bir Mtbı hemen sonra kaynaklanan akut ayrımdan nörotransmitter salınım birikimli etkilerini karakterize kolaylaştırabilir.

Bu model ayrıca hayvanların günde 2 etkiye maruz kalması, bir atlet ilk darbe30kısa bir süre içinde başka bir travmatik etkisi aldığında gibi daha da şiddetli koşullar çalışması mümkün hale sağlar. Bir önceki çalışmada31olarak gösterildiği gibi, kafasına ikinci bir darbe zamanlaması önemli ölçüde vasküler ve aksal hasarı etkileyebilir. İkinci darbe ilk darbe için daha yakın, sonuçları daha zarar. Bu model, bu özel durumun, ekstrellüler nörotransmitter salınımını nasıl etkilediğini araştırmak için uygundur.

Bu yöntemle Hippocampus, sarsıntı araştırmalarında alaka nedeniyle ilgi alanı olarak kullanıldı, ancak mikrodiyaliz örnekleri de ilgi diğer bölgelerinden toplanabilir. Ancak, başka bir beyin bölgesi, onu çevreleyen diş çimento da dahil olmak üzere kılavuz kanül etki sitesi tarafından sol alan dikkate alınmalıdır, sıçan kafasına alan önemli miktarda sürebilir. Buna ek olarak, membran moleküler ağırlık kesme ve aktif uzunluğu gibi bu yöntemle sunulan mikrodiyaliz parametreleri, örnekleme zaman aralıkları ve akış hızı, eğitim alan molekül tipine göre ayarlanabilir. Örneğin, sarsıntı içinde yer alan Pro-inflamatuar sitokinlerin verimli toplanması, çok daha büyük bir gözenek boyutuna sahip bir membran gerektirir.

Protocol

Bu projenin hayvan protokolü, Kanada hayvan bakımı Konseyi ‘nin yönergelerine uygun olarak Hopital du Sacre-Cœur de Montreal hayvan bakım Komitesi ‘nin onayını aldı. Not: araştırma protokolünün şematik anahattı Şekil 1’ de sunulmuştur. 1. hayvan hazırlama Standart bir laboratuar hayvan tedarikçiden Sprague-Dawley fareler sipariş 43 arasında teslim edilecek ve 50 yaş ve 151 ve 200 g arasında bir ağırlık. 12:12 h ışık bir döngüsünde bireysel tüm fareler ev: karanlık, 24-26 °c ‘ de su ve gıda reklam Isteğe bağlı erişimi ile. Protokol başlamadan önce 2 hafta boyunca, araştırmacılar ile temas onların alışkanlık kolaylaştırmak için günlük bazda 5 dakika boyunca fareler ele. Rats hakkında yaşlı olmalıdır 10 hafta eski ve onların ağırlığı arasında olmalıdır 295 ve 351 g sarsıntı veya Sham yaralanma indüksiyon sırasında. 2. mikrodiyaliz Kılavuzu kanül Implantasyon cerrahisi Cerrahi Steril koşullar altında gerçekleştirin. Prosedür boyunca steril eldiven, saç kaputu ve cerrahi maske giyin. Tüm malzemeleri ve cerrahi aletleri önceden otoklav ve sterilize edin. Çalışma alanını ve stereotaktik cihazı, etanol çözeltisi (% 70) ile iyice temizleyin ve dezenfekte edin. İntraperitoneally (70 mg/kg) ve xylazine (10 mg/kg) ketamin bir kokteyl enjekte ederek hayvanları anestezize. Bir ayak tutam refleks test ederek asses anestezik derinliği. Elektrik kesiciler kullanarak hayvanın kafasından kürk çıkarın. 2% izopropresl alkol ve% 2 KLORHEKSİDİN GLUKONAT (3 kez) bir solüsyon kullanarak tıraş kafası temiz. Anestezi sırasında kuruluğu önlemek için yağlama göz merhem uygulayın. Drape-kapalı cerrahi alan böylece sadece hayvanın kafası maruz kalır. Sıçan kafasını stereotaktik bir aparat içine yerleştirin, kulak çubuklarını büyük bir özen ile kulak kanallarına takın ve ardından burun kelepçesini sıkın. Stereotaktik cihazdaki tutucu koluna 26 G paslanmaz çelik kılavuz kanül düzeltin. Lokal olarak kafada subkutan (1,5 mg/kg) ve lidokain (1,5 mg/kg), inilden 10 dakika önce bir anestezik kokteyl enjekte edilir. Sodyum isofluran (2,5%) vererek tüm prosedür sırasında anestezi koruyun at 0,5 L/min oksijen akımı ile burun koni. Bir neşter ile kafa derisi boyunca bir orta çizgi kesi (3 cm) olun. Kesi etrafında 4 kelepçeleri yükleyerek kafatası temiz bırakın. Bregma ve lambda sütürler görünür olana kadar cerrahi bir bıçak ile kafatasından periost sıkıca scrape. Kanama varsa bir gazlı bez Pad veya pamuk uçlu aplikatör ile kafatası üzerinde sağlam basınç koruyun. Bregma ve lambda sütürler dorsoventral koordinatlarını karşılaştırarak kafatası doğru stereotaktik cihaz üzerinde hizalanır olup olmadığını onaylayın. Kılavuzu kanül koordinatları için referans noktaları olarak bregma sütür anteroposterior, mediolateral ve dorsoventral koordinatlarını tanımlayın. Bregma dikiş koordinatlarını referans olarak alarak Hippocampus ‘ta kılavuz kanül implantasyon yerinin koordinatlarını hesaplayın.Not: Aşağıdaki koordinatlar Paxinos ve Watson ‘dan gelen sıçan beyin Atlası ‘na göre belirlendi (anteroposterior:-0,60 cm; mediolateral: ± 0,58 cm; dorsoventral:-0,16 cm, Şekil 2a)32. Bir marker kullanarak kesin implantasyon sitesini işaretleyin. Kılavuz kanülün hedef bölgesinde kafatası üzerinden 0,5 mm ‘lik bir delik delin. Matkap 3 diğer delikler yaklaşık 5 mm bu noktada iplik 3 çapa vida içine diş, kanül geçirecektir sonra akrilik Dental çimento uygulanır. Kanül Hippocampus içine yerleştirin ve diş çimento ile düzeltin. Bu kanül, mikrodiyaliz prosedürü sırasında 7 gün sonra araştırma bölgesini ilgi alanına eklemek için kullanılacaktır. Ağırlık düşecektir site etrafında aşırı diş çimento dökmek değil gibi dikkatli olun. Çimento 2 dakika boyunca kurumaya bırakın, ardından tutucu kolunu kanülün dışına çıkarın. Beyin omurilik sıvısı sızıntı ve enfeksiyon riskleri önlemek için kanül içine paslanmaz çelik çıkarılabilir obturator takın. 4 kelepçeleri çıkarın, geri çekilmiş cildi çekin ve cerrahi sütür iplik 4-0 ile dikiş. Aletten sıçan çıkarın ve ağrı tedavisi için subkutan buprenorfik enjekte (0,05 mg/kg, ameliyattan sonra günde bir kez aşağıdaki 2 gün boyunca). O bilinçli hale gelene kadar altında bir Isıtma Pad ile kafesine geri kemirgen yerleştirin, daha sonra yakın izleme altında 7 gün iyileşme süresi için hayvan bakım tesisi için iade. 3. mikrodiyaliz prosedürü Mikrodiyaliz prosedürü yaparken, steril eldiven, bir saç kaputu ve bir cerrahi maske giyin. Kanül implantasyon cerrahisi takip yedi gün, sodyum izofluran ile sıçan anestezize (2,5%) at 0,5 L/min oksijen akımı. Kanülden obturator çıkarın ve yavaş bir mikro diyaliz prob, yapay serebral omurilik sıvısı (acsf) (26 mmol/l NaHCO3, 3 mmol/l Nah2Po4, 1,3 mmol/l MgCl2, 2,3 mmol/l CAcl2, 3,0 perfüze mmol/L KCl, 126 mmol/L NaCl, 0,2 mmol/L L-askorbik asit), Hippocampus veya ilgi diğer bölgeye kanül aracılığıyla.Not: Rats sadece obturator kaldırarak ve mikrodiyaliz prob ekleme ve beyin sarsıntısı veya Sham yaralanma indüksiyon sırasında anestezize gerekir. Burada kullanılan problar laboratuvar tarafından inşa edilmiş, ı şeklinde, ve erimiş yan yana silika giriş-çıkış hatları oluşur [iç çapı (ID): 50 μm] Polietilen boru kaplı (ID: 0.58-0.38 mm). Kanül sonu rejenere boş selüloz membran uzunluğu ile korunur [molekül ağırlığı Cut-off: 13 kDa, dış çap (OD): 216 μm; KIMLIK: 200 μm] siyanoakrilgeç yapıştırıcı ve epoksi ile mühürlenmiş ucu kullanarak. Aktif membran, Hippocampus implantasyonu için 2,5 mm ölçer ancak ilgi bölgenin derinliğine göre ayarlanabilir. Sıçan diş kanülün prob ile bağlantı takılı, dişli paslanmaz çelik yaka ile güvenli. Prob montajını, Hayvan kafesi içinde serbestçe hareket ettirebilmek için bir halka standı ve kelepçeleri ile kafes üzerinde askıya alınan bir sıvı döner ve sayaç dengesi kolu kolu için bağlı bir paslanmaz çelik yay için düzeltin. Tethered fareler su ve gıda reklam Isteğe bağlı erişimi ile mikrodiyaliz prosedürün tüm süresini harcamak. Problar perfuzatta göndermek için bir mikroinfüzyon pompası kullanın ve erimiş silika çıkış hattı (ölü hacim: 0,79 μL) gelen dializat toplamak. Prosedür başlamadan önce en az 1 h ve 30 dakika, prob çalışma debisi (1 μL/dak) açın. Prob akış hızını bir pipet ile zaman içinde hacmi ölçmek ile tutarlı olduğunu doğrulayın.Not: Akış oranı daha fazla veya daha az nörotransmitter örneklenmiş ve ilgi beyin bölgesi bağlı olarak olabilir. Dializ örnekleri önce, sırasında ve sarsıntı veya Sham yaralanma indüksiyon sonra alınır. Örnekleme aralığı ilgi beyin bölgesine bağlıdır, analiz edilen nörotransmitter, analitin diyalizat konsantrasyonları, ve analitik kimya ekipmanlarının duyarlılık kullanılır. Burada glutamat ve GABA örnekleme için hipokampus içinde yapılan toplama aşamaları aşağıdaki gibidir:1. temel: deney başında, 60 dk için 10 dk aralıklarla diyaliz örnekleri toplamak.2. Post-sarsıntı veya Sham yaralanma: sarsıntı veya Sham yaralanma sonra, ek 90 min (9 numune) için numune toplamak. Her diyalizat örneğini, analitik bozulması önlemek için 1 μL 0,25 MOL/L perklorik asit ile önceden yüklenmiş bir kesirli şişede toplayın. Numuneleri sonraki analizler için 4 °C ‘ de saklayın. Son dializat örneğinin toplanması sonrasında, bir burun koni sodyum izofluran (2,5%) teslim ile sıçan yeniden anestezize 0,5 L/dak oksijen akışına sahiptir. Mikrodiyaliz sondasını kanüden çıkarın, obturatörü yeniden takın ve sonra sıçan hayvanı bakım tesisine geri dönün. 4. sarsıntı aparatı montajı Prosedür başlamadan önce, 450 g bir kitle elde etmek için katı pirinç beyin sarsıntısı (19 mm çapında) vermek için kullanılacak bir ağırlık bölmek. pirinç ağırlığının üst kısmına bir metal döngü yerleştirin. Matkap delikleri, dikey Polivinil klorür (PVC) kılavuz tüpünün içinde 1,0 m mesafeye kadar önön. Keskin bir jilet ile bir alüminyum levha yarık. Oluklu alüminyum levha sıçan ağırlığı desteklemelidir (295 için 351 g) pirinç ağırlığı baş etkisi sonra vücudun ivme ile müdahale etmeden. Bir köpük yastık (37 cm uzunluğunda x 26 cm genişliğinde x 12 cm derinliğinde) içeren bir U-şekilli pleksiglas çerçeve (38 cm uzunluğunda x 27 cm genişliğinde x 30 cm derin, Şekil 3A, B) sıkıca oluklu alüminyum levha teyp. Plexiglas çerçevesini bir PVC kılavuz tüpünün altında konumlandırın (20 mm çapı x 1,5 m uzunluğunda). PVC kılavuz tüpünü, oluklu alüminyumun 3,5 cm üzerinde bir kelepçe standı ile yerinde tutun. Bir naylon sinek balıkçılık hattı (kapasite 9,1 kg, 0,46 mm çapı) metal döngü üzerinden böylece ağırlık alt darbe aşağıdaki köpük yastık düşüyor zaman birden fazla hit önlemek için oluklu alüminyum üzerinde 2,5 cm asılı böylece takın. Naylon sinek balıkçılık hattı kelepçe standı takın. Naylon sinek balıkçılık hattı ile PVC Tüp üzerinden ağırlık çekin sonra 1,0 m de ön delinmiş delikler üzerinden bir hex anahtar ekleyerek yerine tutun. 5. sarsıntı Indüksiyon Diyaliz numunelerinin temel aşamasından sonra, bir burun konisi sodyum isofluran (2,5% Isoflurane 0,5 L/min oksijen akımı) teslim yerleştirerek hafifçe sıçan yeniden anestezize bir ayak tutam bir yanıt olarak (Bölüm 3,1 belirtildiği gibi) kadar. Onun kafası pirinç ağırlığı (Şekil 3c, D) yolunda doğrudan konumlandırılmış böylece oluklu alüminyum levha üzerinde göğsüne hayvan yerleştirin. Burun koni ile anestezi korumak sıçan hareket etmez veya uyandırma kilo önce-up emin olmak için. Burun koni çıkarın ve hex tuşunu çekin. Ağırlık PVC Tüp üzerinden dikey olarak düşecek ve sıçan kafası etkisi. Sıçan hızlı bir 180 ° dönme ve arka arazi (Şekil 3E) geçecek. Köpük yastık gelen sıçan çıkarın ve kendi kafesi onun arkasına yerleştirin. İyileşme ve yaralanma şiddetinin bir işareti olarak nişan refleks süresini ölçmek için bir dijital zamanlayıcı kullanın. Nişan refleks zamanı, kemirgenler uyanana kadar ve kendiliğinden doğru kendilerini sağ pozisyondan meyilli pozisyona, ya da yürümeye başlamak kadar etkisi toplam zamanıdır. Ölüm, kırık veya kanama belirtileri unutmayın.Not: Prosedür tekrarlanan concussions için farklı zaman noktalarında aynı konuda tekrarlanabilir. 6. Sham Indüksiyon Diyaliz numunelerinin temel aşamasından sonra, sodyum isofluran (2,5%) teslim bir burun koni yerleştirerek hafifçe sıçan yeniden anestezize at 0,5 L/min oksijen akımı bir ayak tutam yanıt olarak kadar (bölümünde belirtildiği gibi 3,1). Onun kafası pirinç ağırlığı yolunda doğrudan bırakır böylece oluklu alüminyum levha üzerinde göğsüne hayvan yerleştirin. Sıçan hareket veya uyandırma emin olmak için burun koni ile anestezi koruyun. Burun koni çıkarın ve hex tuşunu çekerek olmadan alüminyum levha hayvan çıkarın. Sıçan hızlı bir 180 ° dönme geçmesi olmayacaktır. Sıçan onun kafesinde geri yerleştirin. Nörolojik restorasyon göstergesi olarak nişan süresini ölçmek için bir dijital zamanlayıcı kullanın. 7. yüksek performanslı sıvı kromatografi Hızlı ayırma floresan algılama ile yüksek performanslı sıvı kromatografi kullanarak preolumn derivatizasyon tarafından nörotransmitter seviyeleri (yani, glutamat ve GABA) belirlemek ve hızlı bir ayırma Otomatik Örnekleyici ve bir pompa birleştiğinde oluşan bir sistem 3,0 x 50 mm 5 μm analitik sütuna kadar. 100 mmol/L sodyum fosfat dibasic (na2HPO4), 3,5% Asetonitril ve% 20 metanol ile mobil faz hazırlayın. PH ‘ı fosforik asit (% 85) ile 6,7 olarak ayarlayın gereklidir. Akış hızını 0,5 mL/dak olarak ayarlayın. Stok çözümlerinden taze günlük derivatizasyon reaktifler ve çalışma standartları (100 ng/mL) hazırlayın. Örnekleri ile soğutulmuş (10 °c) hızlı ayırma Otomatik Örnekleyici içine yükleyin. Her bir kesiti,% 20 μL 3-mercaptopropionik asit (0,071 mol/L) ile, H2o ve 20 μl O-ftaldehit (0,0143 mol/l) ile seyreltilmiş ve 0,1 mol/l sodyum tetraborat ile analiz sütununa sırayla karıştırın. Mix reaksiyon için 10 dakika izin verin. Sonraki numunelerin kontaminasyonunu önlemek için, her enjeksiyonu takiben enjeksiyon döngüsünü metanol (% 20) ile yıkayın.Not: Glutamat saklama süresi yaklaşık bu protokolde 1 dakika, her örnek için 30 dk toplam çalışma süresi olacaktır. Kromatografik zirvelerin analizi sırasında, bilinen standartlardaki saklama zamanlarına göre eşleşen örnekleri kullanarak bilinmeyen zirveleri tanımlayın. Μg/mL olarak analitlerin hızlı seviyeleri. 8. Histoloji Mikrodiyaliz prosedürü ve sarsıntı veya Sham yaralanma indüksiyonu izleyen bir ay, ketamin (70 mg/kg) ve xylazine (10 mg/kg) bir kokteyl enjekte ederek hayvanları anestezize ve civarında formaldehite (% 4) tarafından ötenize ve tuzlu intrakardiyak perfüzyon. Kemirgenleri kesip beyinleri kesecekler. Beyinleri civarında formaldehite ‘da saklayın (% 4) ve daha sonra sakaroz bir çözüm (% 30) onları korumak. 50 μm ‘ nin koronal bölümlerinde beyni bir kriyostat ile dilimleyin. Yaralanma ve prob yerleşimi (Nissl boyama) histolojik doğrulama için kreil menekşe ile beyin dilimleri leke.

Representative Results

Güç ve rotasyonu in vivo serebral mikrodiyaliz ile birleştiren sarsıntı modelimizi kullanarak, bir beyin sarsıntısı veya Sham yaralanması sonrasında akut ekstrelüler glutamat ve GABA değişiklikleri, 21 erkek, Yetişkin, Sprague-Dawley fareler tarafından incelenmiştir hipokampus CA1 bölgesinde bir kılavuz kanül implantasyonu. Prob yerleştirme ve yaralanmanın histolojik olarak doğrulanmasıKreil menekşe ile lekelenmiş bölümlerde Hippocampus doku hasarının histolojik olarak doğrulanması sonrasında büyük intrakerebral kanama veya çürükler gibi morfolojik değişiklikler bildirilmemiştir. Kılavuz kanül implantasyonu ve mikrodiyaliz prob ekleme yaralanan ve Sham vakalar arasında küçük ve benzer hasarlar. Ayrıca, Sham yaralanması veya sarsıntı indüksiyon önce bir mikroskop altında görüldüğü gibi herhangi bir ayırt hipokampus doku hasarı vermediği prob sağ çıkarmadan (Şekil 2B, C, sırasıyla), prob membranı ile hala bozulmamış sonra (Şekil 2D, E). Paraformaldehitlerle perfüzyon (% 4) ile sarsıntı ve Sham yaralanma beyni 1 ay aşağıdaki mikrodiyaliz prosedürleri görsel muayene üzerine ayırt edilemez (Şekil 2F, G). Refleks zaman nişanYaralı gruptan gelen hayvanlar, ortalama Sham davalarında (öğrencinin t-testi, p = 0,042801) (Şekil 4) önemli ölçüde artan bir nişan süresi vardı ve bilinç geri kazanılması üzerine hayrete çıkmıştır. Sarsıntı grubundan 10 olguda, tek bir hayvan, ağırlık düşüşü sonrasında etki alanı altında kanamanın küçük belirtileri gösterdi. Kafatası kırığı veya intrakraniyal kanama belirtisi görülmemiştir. In vivo serebral mikrodiyalizYöntemimizin temsili sonuçlar olarak hareket etmek için 15 10 μL dializat numuneleri Hippocampus, in vivo, 10 dakika aralıklarla ve 1 μL/dak debisi elde edildi. ekstrasellüler düzeyleri glutamat ve GABA ölçülen 6 numuneler temel sırasında ( 60 min) ve 9 numuneden sonra Sham yaralanma veya sarsıntı (90 dk) indüksiyon. Glutamat ekstrsellüler konsantrasyonlarıHippocampus ‘un CA1 bölgesinde, Sham yaralanmasına kıyasla ilk 10 dakika sonra travma indüksiyonunda (Mann-Whitney U testi, p = 0,009175) (Şekil 5) ekstrasellüler glutamat konsantrasyonlarında önemli artışları gözlendi. Diğer zaman noktasında gruplar arasında glutamat konsantrasyonlarında başka bir fark görülmemiştir. GABA ekstrsellüler konsantrasyonlarıHippocampus ‘un CA1 bölgesinde, Sham yaralanmasına kıyasla ilk 10 dk. travma indüksiyonu sırasında GABA konsantrasyonlarında önemli bir değişiklik görülmemiştir (Mann-Whitney U testi, p = 0,943861) (Şekil 6). Sarsıntı vakaları ve Sham yaralanma durumları arasında başka bir zaman noktasında GABA konsantrasyonlarda başka önemli bir fark yoktu. <!– FIGURE LEGENDS: –> Resim 1: araştırma protokolünün şematik taslağı. Bu rakam ıO Masse 2018 değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Şekil 2: prob yerleştirme ve yaralanmanın histolojik olarak doğrulanması. (A) Hippocampus ‘daki mikrodiyaliz prob ve kılavuz kanül yerleştirme yerinin coronal görünümü, Paxinos ve Watson ‘ın stereotaktik atlasını kullanarak. (B) bir mikrodiyaliz prob ve kılavuz kanül tarafından üretilen Hippocampus doku hasarının (kreil menekşe) temsilci photomicrograf bir Sham yaralanma durumda. (C) Hippocampus doku hasarı (kreil menekşe) bir mikrodiyaliz prob ve kılavuz kanül tarafından üretilen bir sarsıntı davasının temsili fotomikografi. (D) sarsıntı indüksiyonunda bir mikrodiyaliz sondasının temsilci fotomikografi. (E) sarsıntı indüksiyonunda bir mikrodiyaliz sondasının temsilci photomicrograf. Membran hala sağlam. (F-G). Bir sahte (F) ve sarsıntının (G) temsili photomicrograf, Sham yaralanması veya sarsıntı işleminden sonra 1 ay içinde% 4 paraformaldehit ile perfüzyon aşağıdaki yaralı beyin. Görsel muayene üzerine, 2 beyin ayırt edilemez. Bu rakam ıO Masse 2018 değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Şekil 3: sarsıntı aparatı ve mikrodiyaliz aletleri temel bileşenler tasvir. (A) fare aşamasında bulunan düşen ağırlık için dikey bir Polivinil klorür (PVC) Kılavuz tüp oluşan tüm montaj bir fotoğraf, pleksiglas çerçeve, köpük yastık, bilgisayar kontrollü mikroinfüzyon pompası, sızdırmaz şırınga, sıvı döner ve yan yana kullanılmış silika giriş-çıkış hatları. (B) Plexiglas çerçevesinin şematik gösterimi ve tüm uyumlu boyutlarda köpük yastık. (C) köpük yastığı üzerinde sıçan aşaması olarak hizmet veren alüminyum folyo oluklu parçanın bir fotoğrafı. (D) aşağı düşen ağırlığı tarafından baş etkisi hemen önce sahnede sıçan konumlandırma gösteren bir fotoğraf. (E) baş etkisi sonra sıçan gösteren bir fotoğraf, baş etkisi sonra sıçan vücudun 180 ° yatay rotasyon gösteren ve ivme ve rotasyon ortaya çıkan. Bu rakam ıO Masse 2018 değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Şekil 4: nişan zamanı. Farelerin anesteziden uyanması ve eğilme pozisyonuna meyilli pozisyona çevirmesi veya beyin sarsıntısı (kırmızı elmaslar, n = 10) veya Sham yaralanması (mavi kareler, n = 11) ile yürümeye başlaması için gerçekleştirilen zamanın histogram temsili. Sarsıntı grubundan fareler, Sham yaralanma grubuna kıyasla kendilerini doğru şekilde daha uzun sürdü. Ortalama değerler her grafikte yatay bir çizgi olarak temsil edilir. * p < 0,05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001. Bu rakam ıO Masse 2018 değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Şekil 5: glutamat Ekstrsellüler konsantrasyonları. Temel sırasında hipokampus mikrodiyaliz (60 min) ve sarsıntıdan sonra (kırmızı elmaslar, n = 10) veya Sham hasarı (mavi kareler, n = 11) koşulları (90 dk) ölçülen glutamat (μg/mL) ortalama ekstrenüler konsantrasyonları. Hata çubukları ortalama standart hata temsil eder. * P < 0,05, * * P < 0,01, * * * P < 0,001. Bu rakam ıO Masse 2018 değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Şekil 6: GABA Ekstrsellüler konsantrasyonları. Temel sırasında hipokampus içinde mikrodiyaliz (60 dk) ve sarsıntıdan sonra (kırmızı elmaslar, n = 10) veya Sham yaralanması (mavi kareler, n = 11) koşulları (90 dk) ile ölçülen GABA (μg/mL) ortalama ekstrelüler konsantrasyonları. Hata çubukları ortalama standart hata temsil eder. * P < 0,05, * * P < 0,01, * * * P < 0,001. Bu rakam ıO Masse 2018 değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Discussion

Protokoldeki kritik adımlar
Güvenilir sonuçlar oluşturmak için, bu protokoldeki kritik adımlar özellikle dikkat gerektirir. Kanül implantasyon cerrahisi sırasında, özellikle etki alanı üzerinde dökülmesini önlemek için çok sıvı olduğunda, gerekli olandan daha fazla çimento kullanmaktan kaçının. İmplantasyon sitesinin engellenmesini önlemek için, kanül ile aynı uzunlukta bir obturator kullanın. Mikrodiyaliz prosedürü sırasında prob yavaş bir şekilde kanül içine yerleştirin ve diyalizat örnekleme için tamamen takılı olduğundan emin olun. Sarsıntı indüksiyon önce, alüminyum levha düzgün keskin bir jilet ile eğimli olduğundan emin olun. Aksi takdirde, pirinç ağırlığı darbe alüminyum levha rip için yeterli olmayacaktır ve sıçan yerine bir 180 ° rotasyon ve arkadan iniş geçiren göğüs aşağı kalacaktır. Bu durumda ise, yaralanmalar indüklenen kör etkisi neden olur, ne açık kafatası ağırlığı damla modellerinde görülen ve önemli ölçüde daha şiddetli olması aksine. Bu sıçan kafatası kritik hasar yaratacaktır gibi sarsıntı indüksiyon sırasında, ağırlık ile kanül etkilemeden kaçının. Deney sırasında manipülasyon hatalarını kısıtlamak için 2 takımlarda çalışmak oldukça tavsiye edilir.

Değişiklikler ve sorun giderme
Mikrodiyaliz prosedürü sırasında, akış sabit olmalıdır ve prob pompana bağlandığında perfüzyon hızına uygun bir hacim vermelidir. Alt hacimler, hatlarda prob veya hava kabarcıklarının membranında tıkanma varlığını gösterebilir. Tıkanma durumunda, prob atılır ve değiştirilmesi gerekir. Ancak, hava kabarcıkları hatlarda ACSF dolaşan tarafından çıkartılabilir. Eğer hiçbir tıkanıklık veya hava kabarcıkları kaydetti ve hala hiçbir akış, sonuna en yakın çıkış tüpü küçük bir parçası kesilebilir.

Yöntemin sınırlamaları
Wayne Devlet Üniversitesi ağırlık düşürme kullanarak diğer çalışmalar bazı temel yapısal ve moleküler değişiklikler değerlendirdi18. Ancak, daha kapsamlı bir soruşturma bu prosedürün meşruiyetini koruyacaktı. Epigenetik ve hücresel seviyelerde yer alan biyolojik ve nöroanatomik değişikliklerle ilgili bilgiler, yöntemimizin güvenilir ve translasyonel değerini daha da pekiştirecekti. Ayrıca, bilişsel fonksiyonun değerlendirilmesi,33kemirgen modellerinde mtbı ile ilgili sonuç güvenilir bir ölçüsüdür. Bu protokolde zaman-sağa ölçüldü ve yaralı olgularda Sham vakalarla karşılaştırıldığında önemli ölçüde gecikmiş olmakla beraber, gelecekte yapılan çalışmalar, kemirgenlerde travma indüksiyonunun ardından fonksiyon ölçümünde bilişsel fonksiyona konsantre olmalıdır.

Mevcut/alternatif yöntemlere göre yöntemin önemi.
Yöntemin ana önemi iki kat: Birincisi, bu Wayne State University prosedürü ile bir sarsıntı başarılı indüksiyon sağlar, hangi hızlı ivme ve kafa ve gövde yavaşlama sağlar. Bu yöntemle kardiyorespiratuar tutuklamalar, kafatası kırığı, yüksek mortalite ve etki bölgesinde görülebilir serebral çürükler belirtileri gibi ciddi yaralanma sonuçları kaçınıldı. İkincisi, bu mikrodializ tekniği başarıyla çoğaltıldı daha önce gösterilen akut ve kısa ömürlü ekstrellüler glutamat salınımı ilk 10 dakika içinde yer alan travma indüksiyon14,16. Ayrıca, probun tüm prosedür boyunca takılı tutulması, tekrarlayan mikrodiyaliz prob ekleme34Ile bağlantılı mtbı duyarlı kan-beyin bariyerine zarar verme olasılığını önemli ölçüde azaltır.

Gelecekteki uygulamalar veya yöntemin yön.
Wayne State Üniversitesi ağırlık düşürme prosedürün kullanımı kolay yönleri ve mikrodiyaliz ile ölçülen akut ekstrelüler nörotransmitter seviyesi değişimleri göz önüne alındığında, mikro diyaliz ve sarsıntıya birleştiren sıçan modelimiz araştırmacılar tarafından güvenilir bir Aracı sadakatle insan kraniyoerebral travma biyomekanik yeniden üretir ve uzunlamasına concussions moleküler etkilerini karakterize. Bizim sıçan modeli aynı zamanda terapötik çalışmalarda geniş bir yelpazede kullanılabilir, bu mekanizma ve farmakolojik ajanların etkinliğini incelemek için değerli bir fırsat sunuyor, sürekli ve hayvan feda etmek zorunda kalmadan. Ayrıca, burada sunulan bir sıçan modelinin kullanılabilirliği, nörotransmitter dengesizlikleri ile concussions davranışsal sonuçları arasındaki ilişkinin daha iyi anlaşılması büyük ölçüde kolaylaştırabilir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz hayvan bakımı ve bakım için Louis Chiocchio için minnettar, Morgane Regniez intrakardiyak perfüzyon prosedürü ile yardım için, ve David Castonguay cryostat ile yardım için. Bu çalışma, universite de Montreal ‘in akut TRAVMATOLOJİSİNDE bulunan Caroline Durand Vakfı Başkanı tarafından LDB ‘ye verildi.

Materials

Animal Preparation
Sprague Dawley Rats Charles River Laboratories SAS SD 40
Name Company Catalog Number Comments
Microdialysis Guide Cannula Implantation Surgery
Ketamine Hydrochloride (100 mg/ml) Bioniche 1989529
Xylazine Hydrochloride (100 mg/ml) Bimeda 8XYL004C
Solution of Chlorhexidine Gluconate 2% and Isopropyl Alcohol 2% Carefusion 260100C
Lidocaine Hydrochloride Alveda Pharma 0122AG01
Bupivacaine Hydrochloride Hospira 1559
Ophthalmic Ointment Baussh and Lomb inc. 2125706
Stereotaxic Frame Stoelting 51600
Stereotaxic Cannula Holder Arm Harvard Apparatus 72-4837
Drill Dremel 8050-N/18
Suture Thread Coated Vicryl Rapide 4-0 Ethicon VR2297
Dental Acrylic Cement Harvard Apparatus 72-6906
Screws JI Morris Company P0090CE125
Isoflurane Baxter CA2L9100
Cannula Gauge 20 10.55mm HRS Scientific C311G/SPC
Dummy-Cannula 10.55mm HRS Scientific C311DC/1/SPC
Name Company Catalog Number Comments
Microdialysis Procedure
CMA 402 Syringe Pump Harvard Apparatus Canada CMA-8003110
Microsyringe 2.5ml Glass Harvard Apparatus Canada CMA-8309021
Syringe Clip Medium For 1-2.5ml Harvard Apparatus Canada CMA-3408310
Low-Torque Dual Channel Quartz-Lined Swivel Instech Laboratories Inc. 375/D/22QM
GSC Cast Iron Support Ring Stand Fisher Scientifique S13748
Fisherbrand Castaloy Adjustable-Angle Clamps Fisher Scientifique 05769Q
NaHCO3 Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich Canada S5761-500G For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
MgCl2 Magnesium Chloride Sigma-Aldrich Canada M8266-100G For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
NaCl Sodium Chloride Sigma-Aldrich Canada S7653-1KG For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
L-Ascorbic Acid Sigma-Aldrich Canada A5960-25G For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
KCl Potassium Chloride Sigma-Aldrich Canada P9333-500G For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
NaH2PO4 Sodium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich Canada S0751-1KG For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
CaCl2 Calcium Chloride Sigma-Aldrich Canada 383147-100G For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
Lighter Canadian Tire For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Epoxy Glue Canadian Tire For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Super Glue Gel Canadian Tire For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Heat Shrink Tube 0.063" Inner Diameter Gardner Bender Canadian Tire For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Cut-Off Wheels Dremel #409 Canadian Tire For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
BD Needle 26 Gauge 0.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305111 Fisher Scientifique 14-826-15 For Laboratory Constructed Probes
BD Needle 21 Gauge 1.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305167 Fisher Scientifique 14-826-5B For Laboratory Constructed Probes
26G Stainless Steel Tubing One Foot HRS Scientific SST-26/FT For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/20 .024" OD X .015" ID HRS Scientific C315CT For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/10 .024" OD X .011" ID HRS Scientific C314CT For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/50 .038" OD X .023" ID HRS Scientific C313CT For Laboratory Constructed Probes
30S WIRE ST.ST 0.008X 1’ Long HRS Scientific 008BSH/30S For Laboratory Constructed Probes
Polymicro Technologies Flexible Fused Silica Capillary Tubing Inner Diameter 50µm, Outer Diameter 150µm Molex LLC Polymicro Technologies 106815-0015 For Laboratory Constructed Probes
Spectra Por 132294 Micro-Dialysis Hollow Fiber Membranes 13 kD MWCO Spectrum Labs FSSP9778671 For Laboratory Constructed Probes
Stainless Steel Collar Sirnay In.c 304 For Laboratory Constructed Probes / Custome made
Name Company Catalog Number Comments
Concussion Apparatus
Brass Weight Rapido Métal Inc. Attach metal loop to base
Metal Loop Rona Inc. Available at most hardware stores
PVC Guide Tube Rona Inc. Available at most hardware stores
Alluminum Foil Alcan Available at most grocery stores
Tape Available commercially
GSC Cast Iron Support Ring Stand Fisher Scientifique S13748
U-Shaped Plexiglas Frame Présentoirs PlexiPlus Inc. Custom made
Foam Cushion Mousse D&R Foam Inc. Custom made
Razor Blades VWR International 55411-055
Super Strong Trilene XT 20 lb. Berkley Canadian Tire Available at most hardware stores
Isoflurane Baxter CA2L9100
Stop Watch Available at most sporting goods retailer
Animal Preparation
Sprague Dawley Rats Charles River Laboratories SAS SD 40
Name Company Catalog Number Comments
Microdialysis Guide Cannula Implantation Surgery
Ketamine Hydrochloride (100 mg/ml) Bioniche 1989529
Xylazine Hydrochloride (100 mg/ml) Bimeda 8XYL004C
Solution of Chlorhexidine Gluconate 2% and Isopropyl Alcohol 2% Carefusion 260100C
Lidocaine Hydrochloride Alveda Pharma 0122AG01
Bupivacaine Hydrochloride Hospira 1559
Ophthalmic Ointment Baussh and Lomb inc. 2125706
Stereotaxic Frame Stoelting 51600
Stereotaxic Cannula Holder Arm Harvard Apparatus 72-4837
Drill Dremel 8050-N/18
Suture Thread Coated Vicryl Rapide 4-0 Ethicon VR2297
Dental Acrylic Cement Harvard Apparatus 72-6906
Screws JI Morris Company P0090CE125
Isoflurane Baxter CA2L9100
Cannula Gauge 20 10.55mm HRS Scientific C311G/SPC
Dummy-Cannula 10.55mm HRS Scientific C311DC/1/SPC
Name Company Catalog Number Comments
Microdialysis Procedure
CMA 402 Syringe Pump Harvard Apparatus Canada CMA-8003110
Microsyringe 2.5ml Glass Harvard Apparatus Canada CMA-8309021
Syringe Clip Medium For 1-2.5ml Harvard Apparatus Canada CMA-3408310
Low-Torque Dual Channel Quartz-Lined Swivel Instech Laboratories Inc. 375/D/22QM
GSC Cast Iron Support Ring Stand Fisher Scientifique S13748
Fisherbrand Castaloy Adjustable-Angle Clamps Fisher Scientifique 05769Q
NaHCO3 Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich Canada S5761-500G For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
MgCl2 Magnesium Chloride Sigma-Aldrich Canada M8266-100G For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
NaCl Sodium Chloride Sigma-Aldrich Canada S7653-1KG For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
L-Ascorbic Acid Sigma-Aldrich Canada A5960-25G For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
KCl Potassium Chloride Sigma-Aldrich Canada P9333-500G For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
NaH2PO4 Sodium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich Canada S0751-1KG For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
CaCl2 Calcium Chloride Sigma-Aldrich Canada 383147-100G For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
Lighter Canadian Tire For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Epoxy Glue Canadian Tire For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Super Glue Gel Canadian Tire For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Heat Shrink Tube 0.063" Inner Diameter Gardner Bender Canadian Tire For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Cut-Off Wheels Dremel #409 Canadian Tire For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
BD Needle 26 Gauge 0.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305111 Fisher Scientifique 14-826-15 For Laboratory Constructed Probes
BD Needle 21 Gauge 1.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305167 Fisher Scientifique 14-826-5B For Laboratory Constructed Probes
26G Stainless Steel Tubing One Foot HRS Scientific SST-26/FT For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/20 .024" OD X .015" ID HRS Scientific C315CT For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/10 .024" OD X .011" ID HRS Scientific C314CT For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/50 .038" OD X .023" ID HRS Scientific C313CT For Laboratory Constructed Probes
30S WIRE ST.ST 0.008X 1’ Long HRS Scientific 008BSH/30S For Laboratory Constructed Probes
Polymicro Technologies Flexible Fused Silica Capillary Tubing Inner Diameter 50µm, Outer Diameter 150µm Molex LLC Polymicro Technologies 106815-0015 For Laboratory Constructed Probes
Spectra Por 132294 Micro-Dialysis Hollow Fiber Membranes 13 kD MWCO Spectrum Labs FSSP9778671 For Laboratory Constructed Probes
Stainless Steel Collar Sirnay In.c 304 For Laboratory Constructed Probes / Custome made
Name Company Catalog Number Comments
Concussion Apparatus
Brass Weight Rapido Métal Inc. Attach metal loop to base
Metal Loop Rona Inc. Available at most hardware stores
PVC Guide Tube Rona Inc. Available at most hardware stores
Alluminum Foil Alcan Available at most grocery stores
Tape Available commercially
GSC Cast Iron Support Ring Stand Fisher Scientifique S13748
U-Shaped Plexiglas Frame Présentoirs PlexiPlus Inc. Custom made
Foam Cushion Mousse D&R Foam Inc. Custom made
Razor Blades VWR International 55411-055
Super Strong Trilene XT 20 lb. Berkley Canadian Tire Available at most hardware stores
Isoflurane Baxter CA2L9100
Stop Watch Available at most sporting goods retailer
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cassidy, J. D., et al. Incidence, risk factors and prevention of mild traumatic brain injury: results of the WHO Collaborating Centre Task Force on Mild Traumatic Brain Injury. Journal of Rehabilitation Medecine. 43, 28-60 (2004).
  2. McCrory, P., et al. What is the definition of sports-related concussion: a systematic review. British Journal of Sports Medecine. 51 (11), 877-887 (2017).
  3. McCrory, P., et al. 5th International Conference on Concussion in Sport (Berlin). British Journal of Sports Medecine. 51 (11), 837 (2017).
  4. Cernak, I. Animal models of head trauma. NeuroRx. 2 (3), 410-422 (2005).
  5. Davis, A. E. Mechanisms of traumatic brain injury: biomechanical, structural and cellular considerations. Critical Care Nursing Quarterly. 23 (3), 1-13 (2000).
  6. Gaetz, M. The neurophysiology of brain injury. Clinical neurophysiology : official journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 115 (1), 4-18 (2004).
  7. Giza, C. C., Hovda, D. A. The new neurometabolic cascade of concussion. Neurosurgery. 75, S24-S33 (2014).
  8. Guerriero, R. M., Giza, C. C., Rotenberg, A. Glutamate and GABA imbalance following traumatic brain injury. Current neurology and neuroscience reports. 15 (5), 27 (2015).
  9. Meldrum, B. S. Glutamate as a neurotransmitter in the brain: review of physiology and pathology. Journal of Nutrition. 130 (4S Suppl), (2000).
  10. Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O’Keefe, J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature. 297 (5868), 681-683 (1982).
  11. Olton, D. S., Papas, B. C. Spatial memory and hippocampal function. Neuropsychologia. 17 (6), 669-682 (1979).
  12. Ray, S. K., Dixon, C. E., Banik, N. L. Molecular mechanisms in the pathogenesis of traumatic brain injury. Histology and histopathology. 17 (4), 1137-1152 (2002).
  13. Reger, M. L., et al. Concussive brain injury enhances fear learning and excitatory processes in the amygdala. Biological Psychiatry. 71 (4), 335-343 (2012).
  14. Faden, A. I., Demediuk, P., Panter, S. S., Vink, R. The role of excitatory amino acids and NMDA receptors in traumatic brain injury. Science. 244 (4906), 798-800 (1989).
  15. Folkersma, H., et al. Increased cerebral (R)-[(11)C]PK11195 uptake and glutamate release in a rat model of traumatic brain injury: a longitudinal pilot study. Journal of neuroinflammation. 8, 67 (2011).
  16. Katayama, Y., Becker, D. P., Tamura, T., Hovda, D. A. Massive increases in extracellular potassium and the indiscriminate release of glutamate following concussive brain injury. Journal of neurosurgery. 73 (6), 889-900 (1990).
  17. Nilsson, P., Hillered, L., Ponten, U., Ungerstedt, U. Changes in cortical extracellular levels of energy-related metabolites and amino acids following concussive brain injury in rats. Journal of cerebral blood flow and metabolism : official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 10 (5), 631-637 (1990).
  18. Kane, M. J., et al. A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury. Journal of neuroscience. 203 (1), 41-49 (2012).
  19. Dewitt, D. S., Perez-Polo, R., Hulsebosch, C. E., Dash, P. K., Robertson, C. S. Challenges in the development of rodent models of mild traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 30 (9), 688-701 (2013).
  20. Eisenberg, M. A., Andrea, J., Meehan, W., Mannix, R. Time interval between concussions and symptom duration. Pediatrics. 132 (1), 8-17 (2013).
  21. Guskiewicz, K. M., et al. Cumulative effects associated with recurrent concussion in collegiate football players: the NCAA Concussion Study. JAMA. 290 (19), 2549-2555 (2003).
  22. Luo, J., et al. Long-term cognitive impairments and pathological alterations in a mouse model of repetitive mild traumatic brain injury. Frontiers in neurology. 5, 12 (2014).
  23. Meehan, W. P., Zhang, J., Mannix, R., Whalen, M. J. Increasing recovery time between injuries improves cognitive outcome after repetitive mild concussive brain injuries in mice. Neurosurgery. 71 (4), 885-891 (2012).
  24. Prins, M. L., Hales, A., Reger, M., Giza, C. C., Hovda, D. A. Repeat traumatic brain injury in the juvenile rat is associated with increased axonal injury and cognitive impairments. Developmental neuroscience. 32 (5-6), 510-518 (2010).
  25. Schwetye, K. E., et al. Traumatic brain injury reduces soluble extracellular amyloid-beta in mice: a methodologically novel combined microdialysis-controlled cortical impact study. Neurobiology of disease. 40 (3), 555-564 (2010).
  26. Shitaka, Y., et al. Repetitive closed-skull traumatic brain injury in mice causes persistent multifocal axonal injury and microglial reactivity. Journal of neuropathology and experimental neurology. 70 (7), 551-567 (2011).
  27. Willie, J. T., et al. Controlled cortical impact traumatic brain injury acutely disrupts wakefulness and extracellular orexin dynamics as determined by intracerebral microdialysis in mice. Journal of neurotrauma. 29 (10), 1908-1921 (2012).
  28. Bolton, A. N., Saatman, K. E. Regional neurodegeneration and gliosis are amplified by mild traumatic brain injury repeated at 24-hour intervals. Journal of neuropathology and experimental neurology. 73 (10), 933-947 (2014).
  29. Blaylock, R. L., Maroon, J. Immunoexcitotoxicity as a central mechanism in chronic traumatic encephalopathy-A unifying hypothesis. Surgical neurology international. 2, 107 (2011).
  30. McCrory, P., Davis, G., Makdissi, M. Second impact syndrome or cerebral swelling after sporting head injury. Current Sports Medecine Reports. 11 (1), 21-23 (2012).
  31. Fujita, M., Wei, E. P., Povlishock, J. T. Intensity- and interval-specific repetitive traumatic brain injury can evoke both axonal and microvascular damage. Journal of Neurotrauma. 29 (12), 2172-2180 (2012).
  32. Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1998).
  33. Bales, J. W., Wagner, A. K., Kline, A. E., Dixon, C. E. Persistent cognitive dysfunction after traumatic brain injury: A dopamine hypothesis. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 33 (7), 981-1003 (2009).
  34. Sumbria, R. K., Klein, J., Bickel, U. Acute depression of energy metabolism after microdialysis probe implantation is distinct from ischemia-induced changes in mouse brain. Neurochemical Research. 36 (1), 109-116 (2011).

Tags

Artificial IntelligenceAI Writing AssistantAI-generated ContentCopywritingContent GenerationText GenerationNLPNatural Language Processing

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Massé, I. O., Moquin, L., Provost, C., Guay, S., Gratton, A., De Beaumont, L. A Novel and Translational Rat Model of Concussion Combining Force and Rotation with In Vivo Cerebral Microdialysis. J. Vis. Exp. (149), e59585, doi:10.3791/59585 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image