生体内脳微小透析における力と回転を組み合わせた脳震盪の新規および翻訳ラットモデル

このプロジェクトの動物プロトコルは、カナダ動物ケア評議会のガイドラインに従って、ホピタル・デュ・サクレ・クール・ド・モントリオールの動物ケア委員会の承認を得ました。 注: 研究プロトコルの概略的な概要を図1に示します。 1. 動物の準備 標準的な実験動物サプライヤーからスプラーグ・ドーリーラットを注文し、生後43~50日の間、体重は151~200gです。 12:12 h光のサイクルで個々にすべてのラットを収容:暗闇、水と食べ物へのアドリビタムアクセスと24-26 °Cで。 プロトコルを開始する前の2週間の間に、研究者と接触して彼らの習慣を容易にするために、毎日5分間ラットを処理します。ラットは生後約10週間で、その体重は脳震盪または偽の傷害誘導時に295〜351gの間でなければなりません。 2. 微小透析ガイドカニューラ移植手術 無菌条件下で手術を行う。無菌手袋、ヘアボンネット、外科用マスクを着用してください。オートクレーブと事前にすべての材料や手術器具を殺菌します。エタノール(70%)の溶液で作業領域と立体装置を徹底的に洗浄し、消毒します。 ケタミン(70mg/kg)とキシラジン(10mg/kg)のカクテルを経口に注入して動物を麻酔する。つま先のピンチに反射をテストすることにより、麻酔の深さをアセス。 電気バリカンを使用して動物の頭から毛皮を取り除きます。2%イソプロピルアルコールと2%クロルヘキシジングルコン酸(3回)の溶液を使用して、きれいに剃った頭部。乾燥を防ぐために麻酔中に潤滑目のチントを適用します。 動物の頭部だけが露出できるように外科場をドレープオフする。ラットの頭部を立体装置に入れ、耳道に耳棒を入れ、鼻クランプを締めます。26 G ステンレススチールガイドカニューレを立体装置のホルダーアームに固定します。 局所的にブピバカイン(1.5 mg/kg)とリドカイン(1.5mg/kg)の麻酔カクテルを頭部に皮下注射し、切開の10分前に注射する。 イソフランナトリウムを送送ることによって全体の手順の間に麻酔を維持する(2.5%)0.5 L/minの酸素の流れでノーズコーンが付いている。 メスで頭皮に沿って中線切開(3センチメートル)を作ります。切開部の周りに4クランプを取り付けることで、頭蓋骨をクリアしたままにしておきます。 ブレグマとラムダの縫合糸が見えるまで、頭蓋骨から骨膜を外科ブレードでしっかりと擦り取ります。出血がある場合は、ガーゼパッドまたは綿先端アプリケータで頭蓋骨にしっかりと圧力を維持します。 ブレグマ縫合糸とラムダ縫合糸の背部音節座標を比較して、頭蓋骨がステレオタキスティック装置上で正しく位置合わせされているかどうかを確認します。ガイドカニューレの座標の基準点として、ブレグマ縫合線の前背部、平背部およびドルソベントラ座標座標を識別します。 Bregma縫合座標を参照として取り、海馬におけるガイドカニューレ移植部位の座標を計算する。注:以下の座標は、パキシノスとワトソンのラット脳アトラスに従って決定された(前置語:-0.60 cm;平行体:±0.58 cm;ドルソベンテラル:-0.16 cm、図2A)32。 マーカーを使用して正確な注入部位をマークします。 ガイドカニューレの標的部位で頭蓋を通して0.5mmの穴を開けます。この点の周りに約5mmの他の穴を開け、アクリル歯科セメントを塗布した後にカニューレを固める3本のアンカーネジを頭蓋骨に通します。 海馬にカニューレを挿入し、歯科セメントでそれを固定します。このカニューレは、微小透析手順の7日後に目的の領域にプローブを挿入するために使用されます。重量が落ちる場所の周りに余分な歯科用セメントがこぼれないように注意してください。 セメントを2分間乾燥させたままにしてから、カニューレからホルダーアームを取り外します。脳脊髄液の浸透と感染のリスクを避けるために、カニューレにステンレス鋼除去可能な観察器を挿入します。 4クランプを取り外し、引き込まれた皮膚を引き戻し、外科縫合糸4-0で縫い合わせる。 装置からラットを取り出し、痛みを治療するために皮下にブプレノルフィンを注入する(0.05mg/kg、手術後、次の2日間に1日1回)。げっ歯類を意識するまで加熱パッドでケージに戻し、7日間の回復期間を動物介護施設に戻します。 3. 微小透析手順 微小透析手順を行っている間、無菌手袋、ヘアボンネットおよび外科マスクを着用する。カニューレ移植手術後7日間、イソフランナトリウムでラットを麻酔する(2.5%)0.5 L/分の酸素の流れで。 カニューレから閉塞器を取り外し、人工脳脊髄液(ACSF)を注入した微小透析プローブ(26 mmol/L NaHCO3、3mmol/L NaH2 PO4、1.3mmol/L MgCl 2、2.3 mmol/L CaCl2、3.0)mmol/L KCl, 126 mmol/L NaCl, 0.2 mmol/L L-アスコルビン酸), 海馬または他の目的の領域にカニューレを介して.注:ラットは、観察器を取り外し、微小透析プローブを挿入する間、および脳震盪または偽の傷害の誘導中にのみ麻酔する必要があります。ここで使用されるプローブは、実験室で構成されたI字型で、ポリエチレンチューブ(ID:0.58-0.38 mm)に包まれた融合されたサイドバイサイドシリカ入口出口ライン[内径(ID):50 μm]で構成されています。カニューレの端部は、再生中空セルロース膜の長さで固定されています [分子量カットオフ: 13 kDa, 外径 (OD): 216 μm;ID:200 μm]シアノアクリレート接着剤とエポキシで密封された先端を使用する。活動的な膜は海馬の注入のために2.5 mmを測定するが、目的の領域の深さに従って調節することができる。プローブへのラットの留置カニューレの接続は、フィットした、スレッドステンレススチールカラーで固定されています。 プローブアセンブリを液体スイベルにつなぎ、ケージの上に吊り下げられたカウンターバランスレバーアームをリングスタンドとクランプで固定し、動物がケージ内を自由に動かすことができるようにします。テザリングラットは、水と食物へのアドリビタムアクセスと微小透析手順の全期間を費やす。 マイクロ注入ポンプを使用してプローブに噴霧を送り、融合シリカ出口ライン(デッドボリューム:0.79 μL)から透析液を収集します。 プロシージャが始まる前に少なくとも1時間30分、プローブを作動流量(1 μL/min)に上げてください。ピペットを使用して時間の経過と共に体積を測定することにより、プローブの流量が一貫していることを確認します。注:流量は、サンプリングされた神経伝達物質と目的の脳領域に応じて多かれ少なかれすることができます.透析サンプルは、脳震盪または偽の傷害誘導の前、中、および後に採取される。サンプリング間隔は、対象の脳領域、分析される神経伝達物質、分析物の透析濃度、および使用される分析化学装置の感度に依存する。グルタミン酸とGABAサンプリングのための海馬でここで行われた収集段階は次のとおりです。1.ベースライン:実験開始時に、透析サンプルを10分間隔で60分間収集します。2.脳震盪後または恥ずかしい傷害:脳震盪または偽の傷害の後、追加の90分(9サンプル)のためのサンプルを集める。 各透析液を0.25モル/L過塩素酸の1 μLをプリロードした分数バイアルで収集し、検体の劣化を防ぎます。その後の分析のために4°Cでサンプルを保存します。 最後の透析液サンプルの採取に続いて、イソフランナトリウムを送り出す鼻コーンでラットを再麻酔する(2.5%)0.5 L/分の酸素の流れで。 カニューレから微小透析プローブを取り出し、オブチュレータを再挿入し、ラットを動物介護施設に戻します。 4. 脳震盪装置の設置 手順の開始前に、固体真鍮から脳震盪(直径19ミリメートル)を与えるために使用される重量を彫り、450 gの質量を得るために真鍮重量の上部に金属ループを挿入します。垂直ポリ塩化ビニル(PVC)ガイドチューブ内の1.0mの距離で予備の穴を開けます。 鋭いかみそり刃でアルミシートをスリットします。スロットアルミシートは、真鍮の重量からの頭部衝撃後の体の加速を妨げることなく、ラット(295~351g)の重量を支える必要があります。 スロット付きアルミシートをU字型のプレキシグラスフレーム(長さ38cm×幅27cm×奥行き30cm、図3A、B)にしっかりとテープを貼り付け、泡クッション(長さ37cm×幅26cm×奥行き12cm)を使用します。 プレキシグラスフレームをPVCガイドチューブ(直径20mm×長さ1.5m)の下に配置します。 PVCガイドチューブを、スロット付きアルミの上に3.5cmのクランプスタンドで固定します。 金属ループを通してナイロンフライフィッシングライン(容量9.1kg、直径0.46mm)を取り付け、ラットが衝撃に続いて泡クッションに落ちたときに複数のヒットを防ぐために、重量の底部がスロットアルミの上に2.5センチメートルハングアップするようにします。 ナイロンフライフィッシングラインをクランプスタンドに取り付けます。 ナイロンフライ釣りラインでPVCチューブを介して重量を引き上げ、1.0 mで予備掘削穴を通して六角キーを挿入することにより、所定の位置に保ちます。 5. 脳震盪誘導 透析サンプル採取のベースライン段階の後、イソフランナトリウムを送送る鼻コーン(0.5L/min酸素流量で2.5%イソフラン)を入れてラットを軽く麻酔し直します(セクション3.1で述べたように)。 その頭が真鍮の重量のパスに直接置かないように、スロット付きアルミシートの上に動物を胸に置きます(図3C,D)。鼻コーンで麻酔を維持し、体重が当たる前にラットが動いたり目覚めたりしないようにします。 ノーズコーンを取り外し、六角キーを引きます。重量はPVCチューブを通して垂直に落ち、ラットの頭部に影響を与えます。ラットは急速な180°回転を受け、背中に着陸します(図3E)。 泡のクッションからラットを取り出し、ケージの背中に置きます。 デジタルタイマーを使用して、回復と怪我の重症度の兆候として右反射時間を測定します。右反射時間は、げっ歯類が目を覚ますまでの衝撃から、自発的に立ち上がり、上垂座から傾向のある位置に自分自身を右に、または歩き始めるまでの合計時間です。死亡、骨折、出血の兆候に注意してください。注:手順は、繰り返し脳震盪のための異なる時点で同じ被験者に繰り返すことができます。 6. シャム誘導 透析サンプル採取のベースライン段階の後、イソフランナトリウムを送送る鼻コーンを置いてラットを軽く麻酔する(2.5%)0.5 L/minの酸素の流れで、つま先のピンチに応答しないまで(セクション3.1で述べたように)。 その頭が真鍮の重量のパスに直接横たわるように、スロットされたアルミニウムシートの上に動物を胸の上に置きます。鼻コーンで麻酔を維持し、ラットが動いたり目覚めたりしないようにします。 ノーズコーンを取り外し、六本鍵を引っ張らずにアルミシートから動物を取り除きます。ラットは急速な180°回転を受け取らない。 ネズミをケージの中に背中に置きます。 神経学的回復の指標として正しい時間を測定するには、デジタルタイマーを使用してください。 7. 高性能液体クロマトグラフィー 急速な分離蛍光検出を伴う高性能液体クロマトグラフィーを用いて前カラム誘導体化により神経伝達物質レベル(すなわち、グルタミン酸およびGABA)を決定し、迅速な分離オートサンプラーとポンプ結合からなるシステム3.0 x 50 mm 5 μm の分析カラムに。 100 mmol/Lリン酸ナトリウムジビベーシック(Na2HPO4)、3.5%アセトニトリルおよび20%メタノールで移動相を調作する。リン酸でpHを6.7に調整する(85%)必要に応じて。 流量を 0.5 mL/min に設定します。 ストックソリューションから新鮮な毎日の誘導性試薬と作業基準(100 ng/mL)を準備します。サンプルと冷蔵(10°C)急速な分離オートサンプラーにそれらをロードします。 各画分を、0.1 mol/Lテトラボレートで希釈したH2Oおよび20 μLのo-フタルデヒド(0.0143モル/L)で希釈した3-メルカプトプロピオン酸(0.071モル/L)の20μLを分析カラムに順次混合します。ミックスが反応する10分を許可します。 次のサンプルの汚染を防ぐために、各注射に続いて、メタノール(20%)で注入ループをフラッシュします。注:グルタミン酸保持時間は、このプロトコルではおよそ1分、各サンプルの合計実行時間は30分です。 クロマトグラフィーピークの分析中に、既知の基準からの保持時間に応じて一致したサンプルを使用して未知のピークを特定します。μg/mLとして解数のレベルを表現します。 8. ヒストロジー 微小透析手順と脳震盪または偽傷害誘導の1ヶ月後、ケタミン(70mg/kg)とキシラジン(10mg/kg)のカクテルを腹腔内に注入して動物を麻酔し、パラホルムアルデヒド(4%)で安楽死させるそして生理生の心内灌流。 げっ歯類の首を切り落とし、脳を解剖する。 パラホルムアルデヒドで脳を保存する (4%)その後、スクロース(30%)の溶液でそれらを凍結保護します。 クライオスタットで50μmの冠状動脈で脳をスライスします。 傷害およびプローブの配置(ニスル染色)の組織学的検証のためにクレシルバイオレットで脳のスライスを染色する。