Summary

İskelet Kas Biyopsisi Prosedüründen İnsan Kas Atası Hücrelerinin İzolasyon, Kültür, Karakterizasyonu ve Farklılaşması

Published: August 23, 2019
doi:

Summary

İskelet kas biyopsi sözünde nizolating, culturing, karakterizasyonu ve insan primer kas atası hücreleri (hMPCs) ayırt etme teknikleri salıyoruz. bu yöntemlerle elde edilen ve karakterize edilen hMPC’ler daha sonra insan miyogenezi ve iskelet kası rejenerasyonu ile ilgili araştırma sorularını ele almak için kullanılabilir.

Abstract

Birincil insan dokusu ve hücrelerinin kullanımı iskelet kası rejeneratif süreci gibi biyolojik ve fizyolojik süreçlerin araştırılması için idealdir. İnsan birincil yetişkin kök hücreleri ile çalışma için tanınan zorluklar vardır, özellikle insan kas progenitor hücreleri (hMPCs) iskelet kas biyopsileri elde, toplanan doku düşük hücre verimi ve donör heterojenlik büyük ölçüde de dahil olmak üzere kültürler arasında büyüme ve ölüm parametreleri. Heterojenliği deneysel tasarıma dahil etmek önemli etkileri tespit etmek için daha büyük bir örnekboyutu gerektirirken, aynı zamanda hMPC genişletme kapasitesinde değişkenliğin altında yatan mekanizmaları belirlememize olanak tanır ve böylece daha iyi anlamamızı sağlar iskelet kası rejenerasyonunda heterojenlik. Kültürlerin genişleme kapasitesini birbirinden ayıran yeni mekanizmalar iskelet kas rejenerasyonunu iyileştirmek için tedavilerin geliştirilmesine yol açma potansiyeline sahiptir.

Introduction

İskelet kası insan vücudundaki en büyük organ sistemidir ve tüm vücut kütlesinin%30−40’ını oluşturur. Hareket onun iyi tanınan rolüne ek olarak, iskelet kası vücut ısısını ve duruşunu korur, ve tüm vücut besin homeostaz merkezi bir rol oynar. İnsan katılımcılar, hayvanlar ve hücre kültürü modellerini içeren araştırmalar iskelet kas biyolojisi ve yenilenme ile ilgili soruları ele almak için değerlidir. İzolasyon ve insan birincil kas atası hücrelerinin kültürü (hMPCs) hücre kültürü teknikleri ve manipülasyonlar insan örneklerine uygulanması için izin veren sağlam bir model sağlar. HMPCs kullanmanın bir avantajı, her donör2,3genetik ve metabolik fenotip korumak olduğunu. Donör fenotipin inbakımı, araştırmacıların miyojenik süreçteki bireysel varyasyonları incelemelerine olanak tanır. Örneğin, hMPC nüfus genişleme kapasitesi4yaş ve cinsiyete bağlı farklılıkları belirlemek için hMPC karakterizasyon yöntemimizi çalıştırdık.

Bu protokolün amacı, hMPC’leri iskelet kas biyopsi dokusundan izole etme, kültür, karakterize etme ve ayırt etme tekniklerini detaylandırmaktır. HMPC’leri tanımlayan ve hMPCyalıtımıiçin potansiyel hücre yüzeyi yapıcıları tanımlayan önceki çalışmalardan oluşan 5,6, bu protokol, hMPC’lerin karakterizasyonuna izolasyon bağlayarak bilgideki kritik bir boşluğu doldurur. Ayrıca, bu protokolde yer alan ayrıntılı adım adım talimatlar, hMPC’lerle sınırlı deneyimi olanlar da dahil olmak üzere, hMPC yalıtımını ve karakterizasyonu geniş bir bilimsel hedef kitle için erişilebilir hale getirir. Protokolümüz hücre popülasyonlarını izlemek için görüntüleme sitometresi kullanımını ilk tanımlayanlardan biridir. Yeni tasarlanmış görüntüleme sitometreleri, bir kültür damarının her kuyusundaki tüm hücrelerin birkaç dakika içinde canlı hücre görüntüleme, hücre sayma ve çok kanallı floresan analizini sağlayan son teknoloji ürünü, yüksek iş sahibi ve mikroplaka tabanlıdır. Bu sistem, tüm hücre popülasyonunun çoğalması ve yaşanabilirliğindeki dinamik değişikliklerin hızlı bir şekilde ölçülmesine ve kültüre en az düzeyde zarar verebilmeye olanak sağlar. Örneğin, farklı bağışçılardan elde edilen her kültürün büyüme kinetiklerini belirlemek için, birbirini izleyen günlerde in vitro birleştiğinde objektif bir araya gelmek için objektif önlemler alabiliriz. Literatürdeki birçok protokol, özellikle MPC’lerin farklılaşmasını içeren protokoller, hücrelerin farklılaşma veya tedaviyi başlatmadan öncetanımlanmış bir kesişme düzeyine ulaşmasını gerektirir 7. Yöntemimiz, araştırmacıların tarafsız, öznel olmayan bir şekilde tedaviye başlamalarına olanak tanıyan bir kültür gemisinde her kuyunun birleşmesi objektif olarak belirlenmesine olanak sağlar.

Geçmişte, birincil hMPCs kullanarak önemli bir sınırlama deneyler için kullanılabilir hücre sayısını sınırlayan düşük verimleri oldu. Biz ve diğerleri iskelet kas biyopsi salgı dokusundan MCD verimi göstermiştir 1−15 MPCs doku miligram başına (Şekil 1)8. Protokolümüz floresan aktif hücre sıralaması (FACS) ile arınma öncesinde hücrelerin dört geçişine izin verdiği için, az miktarda biyopsi dokusundan (50−100 mg) elde edilen kriyopayrılmış hMPC verimlerimiz araştırma amaçlarını ele almak için yeterlidir. birden fazla deney gereklidir. FACS protokolümüz ~%80 saf (Pax7 pozitif) MPC popülasyonu üretir, böylece protokolümüz hem verim hem de saflık için optimize edilsin.

Protocol

Bu protokol Cornell Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır. Tüm katılımcılar altta yatan sağlık koşulları için tarandı ve bilgilendirilmiş onay verildi. 1. İskelet Kas Biyopsisi ile İnsan Kas Dokusu Elde Palpasyon yoluyla vastus lateralis kas tanımlayın, anatomik yerler, ve kas aktif kasılması. Palpate vastus lateralis katılımcı onların quadriceps kas sıkın ve kas ın göbek bulmak, yaklaşık 1/3 patella kalça yolu, ve …

Representative Results

HMPC izolasyonunun insan kas dokusundan temsili akış sitometrisi sonuçları Şekil1’de görülebilir. hMPC’ler ölü hücreleri veya döküntüleri ortadan kaldırmak için yan dağılım aveğine ve ileri saçılmaya dayalı ilk gating olayları ile tanımlanabilir, ardından sadece 7-AAD için negatif olan hücreler seçilebilir ve bu nedenle uygulanabilir. Hem hücre yüzeyi belirteçleri CD56 hem de CD29 için pozitif hücrelerin seçimi hMPC popülasy…

Discussion

Primer hMPCs iskelet kas biyolojisi ve rejeneratif süreci anlamak için kullanılan önemli bir araştırma modelidir. Ayrıca, hMPCs tedavi için kullanılmak üzere potansiyele sahiptir. Ancak, insanlar dan elde edilen hücrelerin sınırlı anlayış da dahil olmak üzere, hem araştırma ve tedavi için birincil hMPCs kullanarak tanınan zorluklar vardır10. Ayrıca donör kültürler arasında genişleme kapasitesinde büyük ölçüde varyasyon vardır, bu da hMPC’lerin kullanım potansiyel…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar Floresan aktif hücre sıralama ile yardım için Cornell Üniversitesi, Biyoteknoloji Kaynak Merkezi Görüntüleme Tesisi teşekkür ederiz. Ayrıca molly Gheller’a katılımcı alımına yardımları için ve Erica Bender’a iskelet kası biyopsilerini yaptığı için teşekkür ederiz. Son olarak katılımcılara zamanları ve çalışmaya katılımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, R01AG058630 Ödül Numarası altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Yaşlanma Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenmiştir (B.D.C. ve A.E.T.), Glenn Vakfı Tıbbi Araştırma ve Amerikan Federasyonu Tarafından Yaşlanma Araştırma Hibe junior fakülte (B için . D.C.), ve Cornell Kadınlar Için Başkan Konseyi tarafından (A.E.T.’ye).

Materials

0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA Corning 25-053-Cl Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels
10 cm cell culture plate VWR 664160 Plates used for culturing hMPCs
15 mL Falcon tube Falcon 352196 15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols
24 well cell culture plate Grenier Bio-One 662 160 Plates used for culturing hMPCs
7-AAD Viability Staining Solution eBioscience 00-6993-50 Viability stain for identifying living cells during FACS sorting
Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16 BioLegend 303016 Conjugated antibody for FACS 
Black 96-well cell culture plate Grenier Bio-One 655079 96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S
Celigo S Nexcelcom Bioscience Imaging cytometer used to track hMPC cultures
Cell Strainer VWR 352350 Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing
Collagen Type I (Rat Tail) Corning 354236 Collagen for coating cell culture plates 
Collagenase D Roche 11 088 882 001 Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue
Dimethyl Sulfoxide VWR WN182 Used for cryopreservation of hMPCs
Dispase II Sigma Life Sciences D4693 A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue
Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose powder Gibco 31600-034 Low glucose DMEM for muscle biopsy processing
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco 21600-010 PBS for muscle biopsy processing
EDTA Disodium Salt Dihydrate J.T. Baker 4040-01  Required for FACS buffer
Fetal Bovine Serum VWR 89510-186  Fetal bovine serum used for hMPC growth media
Ham's F12 Gibco 21700-026 Base media for hMPCs
Heat Inactivated Equine Serum Gibco 26-050-070 Horse serum used to make hMPC differentiation media
Hemocytometer iNCyto DHC-N0105 Used to count cells
Hibernate A Gibco A1247501 Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate Life Technologies H21492 DNA stain for identifying all cells using the Celigo S
Isopropanol Fisher Scientific A416P-4 Used for controlled rate freezing of hMPCs
Moxi buffer Orflo MXA006 Buffer for automated cell counter
Moxi Cassettes Orflo MXC002 Cassesttes for automated cell counter
Moxi z Mini Automated Cell Counter Orflo Automated cell counter
Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific 5100-0001 Commerically available controlled rate cell freezing container
Normal Goat Serum (10%) Thermo Fisher Scientific 50062Z Goat serum used in FACS buffer
PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159 BD Pharmingen 557747 Conjugated antibody for FACS 
Penicillin/Streptomycin 100X Solution Corning 30-002-CI Antibiotics added to culture media
Propidium iodide Thermo Fisher Scientific P3566 DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S
Recombinant Human basic fibroblast growth factor Promega G5071 Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation
Recovery Cell Culture Freezing Medium  Gibco 12648-010 Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S233-3 Added to Ham's F12
Sterile Round Bottom 5 mL tubes VWR 60818-565 Tubes used for FACS
UltraComp eBeads eBioscience 01-2222-42 Compensation beads fort calibrating flow FACS settings

References

  1. Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied Physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
  2. D’Souza, D. M., et al. Decreased satellite cell number and function in humans and mice with type 1 diabetes is the result of altered notch signaling. Diabetes. 65 (10), 3053-3061 (2016).
  3. Scheele, C., et al. Satellite cells derived from Obese humans with type 2 diabetes and differentiated into Myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6. PLoS One. 7 (6), e39657 (2012).
  4. Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. E. Expansion capacity of human muscle progenitor cells differs by age, sex, and metabolic fuel preference. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 315 (5), C643-C652 (2018).
  5. Charville, G. W., et al. Ex vivo expansion and in vivo self-renewal of human muscle stem cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).
  6. Alexander, M. S., et al. CD82 Is a Marker for Prospective Isolation of Human Muscle Satellite Cells and Is Linked to Muscular Dystrophies. Cell Stem Cell. 19 (6), 800-807 (2016).
  7. Thalacker-Mercer, A., et al. Cluster analysis reveals differential transcript profiles associated with resistance training-induced human skeletal muscle hypertrophy. Physiological Genomics. 45 (12), 499-507 (2013).
  8. Garcia, S. M., et al. High-Yield Purification, Preservation, and Serial Transplantation of Human Satellite Cells. Stem Cell Reports. 10 (3), 1160-1174 (2018).
  9. Yokoyama, W. M., Thompson, M. L., Ehrhardt, R. O. Cryopreservation and thawing of cells. Current Protocols in Immunology. , (2012).
  10. Bareja, A., Billin, A. N. Satellite cell therapy – from mice to men. Skeletal Muscle. 3 (1), 2 (2013).
  11. Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. Transcript profile distinguishes variability in human myogenic progenitor cell expansion capacity. Physiological Genomics. 50 (10), 817-827 (2018).
  12. Xu, X., et al. Human Satellite Cell Transplantation and Regeneration from Diverse Skeletal Muscles. Stem Cell Reports. 5 (3), 419-434 (2015).

Play Video

Cite This Article
Gheller, B. J., Blum, J., Soueid-Baumgarten, S., Bender, E., Cosgrove, B. D., Thalacker-Mercer, A. Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure. J. Vis. Exp. (150), e59580, doi:10.3791/59580 (2019).

View Video