Isolatie, cultuur, karakterisering, en differentiatie van menselijke spier voorlopercellen van de skeletspier biopsie procedure

Skeletspieren is het grootste orgaansysteem in het menselijk lichaam, dat 30 − 40% van het hele lichaam massa¹. Naast zijn goed erkende rol in motoriek, skeletspieren handhaaft lichaamstemperatuur en houding, en speelt een centrale rol in het hele lichaam nutriënt homeostase. Onderzoek waarbij menselijke deelnemers, dieren en celkweek modellen betrokken zijn, zijn allemaal waardevol om vragen te beantwoorden die betrekking hebben op de biologie en regeneratie van skeletspieren. Isolatie en cultuur van menselijke primaire spier voorlopercellen (Hmpc’s) biedt een robuust model waarmee celkweek technieken en manipulaties kunnen worden toegepast op menselijke monsters. Een voordeel van het gebruik van hmpc’s is dat zij het genetische en metabole fenotype van elke donor^2,3behouden. Door het onderhoud van het fenotype van de donor kunnen onderzoekers de Inter-individuele variatie in het myogene proces onderzoeken. We hebben bijvoorbeeld onze hMPC-karakterisatie methode gebruikt om leeftijds-en geslachts verschillen in de hMPC-uitbreidingscapaciteit⁴te identificeren.

Het doel van dit protocol is om gedetailleerde technieken te isoleren, cultuur, karakteriseren, en differentiëren hMPCs van skeletspieren biopsie weefsel. Voortbouwend op eerder werk dat hmpc’s beschreef en potentiële celoppervlakte makers voor hmpc Isolation^5,6identificeerde, vult dit protocol een kritieke kloof in kennis door de isolatie te koppelen aan de karakterisering van hmpcs. Verder maken de gedetailleerde stapsgewijze instructies in dit protocol hMPC-isolatie en karakterisering toegankelijk voor een breed wetenschappelijk publiek, inclusief mensen met beperkte voorafgaande ervaring met hMPCs. Ons protocol is een van de eersten die het gebruik van een beeldvormings cytometer beschrijven om celpopulaties te volgen. Nieuw ontworpen beeldvormings Cytometers zijn State-of-the-Art, high-throughput en Microplate-gebaseerd, waardoor Live-celbeeldvorming, celtellingen en meerkanaals fluorescentie analyse van alle cellen in elke put van een kweek vaartuig binnen enkele minuten mogelijk is. Dit systeem zorgt voor een snelle kwantificering van dynamische veranderingen in de proliferatie en levensvatbaarheid van een volledige celpopulatie, met slechts minimale verstoring van de cultuur. Zo kunnen we op opeenvolgende dagen in vitro objectieve maatregelen van samenvloeiing uitvoeren om de groei kinetiek van elke uit verschillende donoren afkomstige cultuur te bepalen. Veel protocollen in de literatuur, met name die met betrekking tot de differentiatie van de Mpc’s, vereisen dat cellen een bepaald niveau van samenvloeiing bereiken voordat differentiatie of behandeling⁷wordt gestart. Onze methode zorgt voor een objectieve bepaling van de samenvloeiing van elke put in een kweek vaartuig, waardoor onderzoekers de behandeling op een onbevooroordeelde, niet-subjectieve manier kunnen initiëren.

In het verleden was een grote beperking van het gebruik van primaire Hmpc’s lage opbrengsten die het aantal beschikbare cellen voor experimenten beperken. Wij en anderen hebben aangetoond dat de opbrengst van de Mpc’s van skeletspieren biopsie weefsel is 1 − 15 MPCs per milligram weefsel (Figuur 1)⁸. Omdat ons protocol vier passages van de cellen toestaat voorafgaand aan zuivering met fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS), zijn onze cryopreserved hMPC-opbrengsten, afgeleid van kleine hoeveelheden biopsie weefsel (50 − 100 mg), voldoende om onderzoeksdoelen te adressen waar Er zijn meerdere experimenten vereist. Ons FACS-protocol produceert een ~ 80% pure (Pax7 positive) MPC populatie, dus ons protocol is geoptimaliseerd voor zowel opbrengst als zuiverheid.