骨格筋生検手順からのヒト筋前駆細胞の単離、培養、特徴付け、分化
Summary
骨格筋生検組織から得られたヒト原発性筋前駆細胞(hMpAc)を分離、培養、特徴付け、分化する技術を提示する。これらの方法によって得られ、特徴付けられたhMpPCは、その後、ヒトの筋形成および骨格筋再生に関連する研究の質問に対処するために使用することができる。
Abstract
一次ヒト組織および細胞の使用は骨格筋再生プロセスのような生物学的および生理学的プロセスの調査にとって理想的である。ヒト原発性成人幹細胞、特に骨格筋生検に由来するヒト筋肉前駆細胞(hMpC)を用いて働く上で認識された課題があり、採取された組織からの低細胞収率およびドナーの大きな不均一性を含む。文化間の成長と死のパラメータ。不均一性を実験設計に組み込むには、有意な効果を検出するためにより大きなサンプルサイズが必要ですが、hMPC拡張能力の変動性を支えるメカニズムを特定できるため、より深く理解することができます。骨格筋再生における不均一性。培養能力の拡大能力を区別する新しいメカニズムは、骨格筋再生を改善する治療法の開発につながる可能性を秘めている。
Introduction
骨格筋は人体最大の臓器系であり、全身質量1の30~40%を占める。運動におけるそのよく認識された役割に加えて、骨格筋は体温と姿勢を維持し、全身栄養恒常性の中心的な役割を果たしています。人間の参加者、動物、および細胞培養モデルを含む研究はすべて、骨格筋生物学と再生に関する問題に対処するために価値があります。ヒト原発性筋前駆細胞(hMpC)の単離および培養は、細胞培養技術および操作をヒトサンプルに適用することを可能にする堅牢なモデルを提供する。hMpCを使用する利点は、各ドナー2、3からの遺伝的および代謝表現型を保持することです。ドナー表現型の維持は、研究者が筋原性プロセスにおける個々の変動を調べることを可能にする。例えば、hMPC人口拡大能力4の年齢と性別の違いを特定するために、hMPC特性分類法を採用しています。
このプロトコルの目的は、骨格筋生検組織からHMPCを分離、培養、特徴付け、および区別する技術を詳細に説明することです。hMPCを記述し、hMPC分離5、6の潜在的な細胞表面メーカーを同定した前の研究に基づいて、このプロトコルは、hMPCの特性に分離をリンクすることにより、知識の重要なギャップを埋めます。さらに、このプロトコルに含まれる詳細なステップバイステップの指示により、hMPCの分離と特性評価は、hMPCの経験が限られているものを含む幅広い科学的聴衆にアクセス可能になります。我々のプロトコルは、細胞集団を追跡するためのイメージングサイトメーターの使用を記述する最初の一つである。新しく設計されたイメージングサイトメーターは、最先端のハイスループットおよびマイクロプレートベースで、培養容器の各ウェル内のすべての細胞の生細胞イメージング、細胞カウント、多チャンネル蛍光解析を数分以内に可能にします。このシステムは、培養への中断を最小限に抑えながら、細胞集団全体の増殖および生存率の動的変化を迅速に定量することを可能にする。例えば、我々は、異なるドナーから派生した各培養物の成長運動学を決定するために、インビトロで連続した日に合流の客観的な測定を行うことができる。文献中の多くのプロトコル、特にLPCの分化を伴うプロトコルは、分化または治療7を開始する前に、細胞が合流の定義されたレベルに達する必要がある。我々の方法は、研究者が公平で非主観的な方法で治療を開始することを可能にする培養容器内の各井戸の合流を客観的に決定することを可能にする。
以前は、一次hMpNCを使用する主な制限は、実験に利用可能な細胞の数を制限する低収率でした。我々および他の人は、骨格筋生検組織からのMpCの収率が組織のミリグラム当たり1−15 PPCであることを示している(図1)8.私たちのプロトコルは、蛍光活性化細胞選別(FACS)で精製する前に細胞の4つの通路を可能にするので、私たちの凍結保存されたhMPC収率は、少量の生検組織(50−100 mg)に由来し、研究目的に対処するのに十分です。複数の実験が必要です。当社のFACSプロトコルは、約80%の純粋な(Pax7陽性)MPC母集団を生成するため、当社のプロトコルは収量と純度の両方に最適化されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
一次hMpPCは、骨格筋生物学と再生プロセスを理解するために使用される重要な研究モデルです。さらに、hMpCは治療に使用される可能性を秘めている。しかし、ヒト10に由来する細胞の限られた理解を含む、研究と治療の両方に一次hMpCを使用する上で認識された課題がある。ドナー培養物間の膨張能力のばらつきも大きく、hMPCの使用の可能性を制限し、研究結果…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、コーネル大学、バイオテクノロジー・リソース・センター・イメージング・ファシリティーが蛍光活性化細胞選別に協力してくれたことに感謝している。また、モリー・ゲラーが参加者募集に協力してくれたことに感謝し、エリカ・ベンダーが骨格筋生検を行った。最後に、参加者の時間と研究への参加に感謝します。この研究は、国立衛生研究所の高齢化に関する国立研究所の助成金番号R01AG058630(B.D.C.およびA.E.T.)の下で、グレン医学研究財団と米国若手教員のための老化研究助成金連盟(Bに対して)によって支援されました。.D.C.)、およびコーネル女性のための大統領評議会(A.E.T.に)によって。
Materials
| 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-Cl | Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels |
| 10 cm cell culture plate | VWR | 664160 | Plates used for culturing hMPCs |
| 15 mL Falcon tube | Falcon | 352196 | 15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols |
| 24 well cell culture plate | Grenier Bio-One | 662 160 | Plates used for culturing hMPCs |
| 7-AAD Viability Staining Solution | eBioscience | 00-6993-50 | Viability stain for identifying living cells during FACS sorting |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16 | BioLegend | 303016 | Conjugated antibody for FACS |
| Black 96-well cell culture plate | Grenier Bio-One | 655079 | 96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S |
| Celigo S | Nexcelcom Bioscience | Imaging cytometer used to track hMPC cultures | |
| Cell Strainer | VWR | 352350 | Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing |
| Collagen Type I (Rat Tail) | Corning | 354236 | Collagen for coating cell culture plates |
| Collagenase D | Roche | 11 088 882 001 | Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue |
| Dimethyl Sulfoxide | VWR | WN182 | Used for cryopreservation of hMPCs |
| Dispase II | Sigma Life Sciences | D4693 | A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose powder | Gibco | 31600-034 | Low glucose DMEM for muscle biopsy processing |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 21600-010 | PBS for muscle biopsy processing |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | J.T. Baker | 4040-01 | Required for FACS buffer |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 89510-186 | Fetal bovine serum used for hMPC growth media |
| Ham's F12 | Gibco | 21700-026 | Base media for hMPCs |
| Heat Inactivated Equine Serum | Gibco | 26-050-070 | Horse serum used to make hMPC differentiation media |
| Hemocytometer | iNCyto | DHC-N0105 | Used to count cells |
| Hibernate A | Gibco | A1247501 | Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue |
| Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate | Life Technologies | H21492 | DNA stain for identifying all cells using the Celigo S |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416P-4 | Used for controlled rate freezing of hMPCs |
| Moxi buffer | Orflo | MXA006 | Buffer for automated cell counter |
| Moxi Cassettes | Orflo | MXC002 | Cassesttes for automated cell counter |
| Moxi z Mini Automated Cell Counter | Orflo | Automated cell counter | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | Commerically available controlled rate cell freezing container |
| Normal Goat Serum (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Goat serum used in FACS buffer |
| PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159 | BD Pharmingen | 557747 | Conjugated antibody for FACS |
| Penicillin/Streptomycin 100X Solution | Corning | 30-002-CI | Antibiotics added to culture media |
| Propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S |
| Recombinant Human basic fibroblast growth factor | Promega | G5071 | Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Gibco | 12648-010 | Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | Added to Ham's F12 |
| Sterile Round Bottom 5 mL tubes | VWR | 60818-565 | Tubes used for FACS |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | Compensation beads fort calibrating flow FACS settings |
References
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