Summary

骨格筋生検手順からのヒト筋前駆細胞の単離、培養、特徴付け、分化

Published: August 23, 2019
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Summary

骨格筋生検組織から得られたヒト原発性筋前駆細胞(hMpAc)を分離、培養、特徴付け、分化する技術を提示する。これらの方法によって得られ、特徴付けられたhMpPCは、その後、ヒトの筋形成および骨格筋再生に関連する研究の質問に対処するために使用することができる。

Abstract

一次ヒト組織および細胞の使用は骨格筋再生プロセスのような生物学的および生理学的プロセスの調査にとって理想的である。ヒト原発性成人幹細胞、特に骨格筋生検に由来するヒト筋肉前駆細胞(hMpC)を用いて働く上で認識された課題があり、採取された組織からの低細胞収率およびドナーの大きな不均一性を含む。文化間の成長と死のパラメータ。不均一性を実験設計に組み込むには、有意な効果を検出するためにより大きなサンプルサイズが必要ですが、hMPC拡張能力の変動性を支えるメカニズムを特定できるため、より深く理解することができます。骨格筋再生における不均一性。培養能力の拡大能力を区別する新しいメカニズムは、骨格筋再生を改善する治療法の開発につながる可能性を秘めている。

Introduction

骨格筋は人体最大の臓器系であり、全身質量1の30~40%を占める。運動におけるそのよく認識された役割に加えて、骨格筋は体温と姿勢を維持し、全身栄養恒常性の中心的な役割を果たしています。人間の参加者、動物、および細胞培養モデルを含む研究はすべて、骨格筋生物学と再生に関する問題に対処するために価値があります。ヒト原発性筋前駆細胞(hMpC)の単離および培養は、細胞培養技術および操作をヒトサンプルに適用することを可能にする堅牢なモデルを提供する。hMpCを使用する利点は、各ドナー2、3からの遺伝的および代謝表現型を保持することです。ドナー表現型の維持は、研究者が筋原性プロセスにおける個々の変動を調べることを可能にする。例えば、hMPC人口拡大能力4の年齢と性別の違いを特定するために、hMPC特性分類法を採用しています。

このプロトコルの目的は、骨格筋生検組織からHMPCを分離、培養、特徴付け、および区別する技術を詳細に説明することです。hMPCを記述し、hMPC分離5、6の潜在的な細胞表面メーカーを同定した前の研究に基づいて、このプロトコルは、hMPCの特性に分離をリンクすることにより、知識の重要なギャップを埋めます。さらに、このプロトコルに含まれる詳細なステップバイステップの指示により、hMPCの分離と特性評価は、hMPCの経験が限られているものを含む幅広い科学的聴衆にアクセス可能になります。我々のプロトコルは、細胞集団を追跡するためのイメージングサイトメーターの使用を記述する最初の一つである。新しく設計されたイメージングサイトメーターは、最先端のハイスループットおよびマイクロプレートベースで、培養容器の各ウェル内のすべての細胞の生細胞イメージング、細胞カウント、多チャンネル蛍光解析を数分以内に可能にします。このシステムは、培養への中断を最小限に抑えながら、細胞集団全体の増殖および生存率の動的変化を迅速に定量することを可能にする。例えば、我々は、異なるドナーから派生した各培養物の成長運動学を決定するために、インビトロで連続した日に合流の客観的な測定を行うことができる。文献中の多くのプロトコル、特にLPCの分化を伴うプロトコルは、分化または治療7を開始する前に、細胞が合流の定義されたレベルに達する必要がある。我々の方法は、研究者が公平で非主観的な方法で治療を開始することを可能にする培養容器内の各井戸の合流を客観的に決定することを可能にする。

以前は、一次hMpNCを使用する主な制限は、実験に利用可能な細胞の数を制限する低収率でした。我々および他の人は、骨格筋生検組織からのMpCの収率が組織のミリグラム当たり1−15 PPCであることを示している(図1)8.私たちのプロトコルは、蛍光活性化細胞選別(FACS)で精製する前に細胞の4つの通路を可能にするので、私たちの凍結保存されたhMPC収率は、少量の生検組織(50−100 mg)に由来し、研究目的に対処するのに十分です。複数の実験が必要です。当社のFACSプロトコルは、約80%の純粋な(Pax7陽性)MPC母集団を生成するため、当社のプロトコルは収量と純度の両方に最適化されています。

Protocol

このプロトコルは、コーネル大学の機関審査委員会によって承認されました.すべての参加者は、基礎となる健康状態についてスクリーニングされ、インフォームドコンセントを与えられた。 骨格筋生検によるヒト筋肉組織の取得 触診、解剖学的ランドマーク、および筋肉の活発な収縮を介して広大な横索筋を識別します。 参加者に四頭筋を締め付け、膝…

Representative Results

ヒト筋肉組織からのhMPC単離の代表的なフローサイトメトリー結果を図1に見ることができる。hMPCは、死んだ細胞や破片を除去するために、サイドスキャッタとフォワードスキャッタに基づく最初のゲーティングイベントによって識別され、続いて7-AADに対して負のセルのみを選択し、したがって実行可能です。細胞表面マーカーCD56およびCD29の両…

Discussion

一次hMpPCは、骨格筋生物学と再生プロセスを理解するために使用される重要な研究モデルです。さらに、hMpCは治療に使用される可能性を秘めている。しかし、ヒト10に由来する細胞の限られた理解を含む、研究と治療の両方に一次hMpCを使用する上で認識された課題がある。ドナー培養物間の膨張能力のばらつきも大きく、hMPCの使用の可能性を制限し、研究結果…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、コーネル大学、バイオテクノロジー・リソース・センター・イメージング・ファシリティーが蛍光活性化細胞選別に協力してくれたことに感謝している。また、モリー・ゲラーが参加者募集に協力してくれたことに感謝し、エリカ・ベンダーが骨格筋生検を行った。最後に、参加者の時間と研究への参加に感謝します。この研究は、国立衛生研究所の高齢化に関する国立研究所の助成金番号R01AG058630(B.D.C.およびA.E.T.)の下で、グレン医学研究財団と米国若手教員のための老化研究助成金連盟(Bに対して)によって支援されました。.D.C.)、およびコーネル女性のための大統領評議会(A.E.T.に)によって。

Materials

0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA Corning 25-053-Cl Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels
10 cm cell culture plate VWR 664160 Plates used for culturing hMPCs
15 mL Falcon tube Falcon 352196 15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols
24 well cell culture plate Grenier Bio-One 662 160 Plates used for culturing hMPCs
7-AAD Viability Staining Solution eBioscience 00-6993-50 Viability stain for identifying living cells during FACS sorting
Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16 BioLegend 303016 Conjugated antibody for FACS 
Black 96-well cell culture plate Grenier Bio-One 655079 96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S
Celigo S Nexcelcom Bioscience Imaging cytometer used to track hMPC cultures
Cell Strainer VWR 352350 Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing
Collagen Type I (Rat Tail) Corning 354236 Collagen for coating cell culture plates 
Collagenase D Roche 11 088 882 001 Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue
Dimethyl Sulfoxide VWR WN182 Used for cryopreservation of hMPCs
Dispase II Sigma Life Sciences D4693 A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue
Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose powder Gibco 31600-034 Low glucose DMEM for muscle biopsy processing
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco 21600-010 PBS for muscle biopsy processing
EDTA Disodium Salt Dihydrate J.T. Baker 4040-01  Required for FACS buffer
Fetal Bovine Serum VWR 89510-186  Fetal bovine serum used for hMPC growth media
Ham's F12 Gibco 21700-026 Base media for hMPCs
Heat Inactivated Equine Serum Gibco 26-050-070 Horse serum used to make hMPC differentiation media
Hemocytometer iNCyto DHC-N0105 Used to count cells
Hibernate A Gibco A1247501 Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate Life Technologies H21492 DNA stain for identifying all cells using the Celigo S
Isopropanol Fisher Scientific A416P-4 Used for controlled rate freezing of hMPCs
Moxi buffer Orflo MXA006 Buffer for automated cell counter
Moxi Cassettes Orflo MXC002 Cassesttes for automated cell counter
Moxi z Mini Automated Cell Counter Orflo Automated cell counter
Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific 5100-0001 Commerically available controlled rate cell freezing container
Normal Goat Serum (10%) Thermo Fisher Scientific 50062Z Goat serum used in FACS buffer
PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159 BD Pharmingen 557747 Conjugated antibody for FACS 
Penicillin/Streptomycin 100X Solution Corning 30-002-CI Antibiotics added to culture media
Propidium iodide Thermo Fisher Scientific P3566 DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S
Recombinant Human basic fibroblast growth factor Promega G5071 Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation
Recovery Cell Culture Freezing Medium  Gibco 12648-010 Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S233-3 Added to Ham's F12
Sterile Round Bottom 5 mL tubes VWR 60818-565 Tubes used for FACS
UltraComp eBeads eBioscience 01-2222-42 Compensation beads fort calibrating flow FACS settings

References

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Cite This Article
Gheller, B. J., Blum, J., Soueid-Baumgarten, S., Bender, E., Cosgrove, B. D., Thalacker-Mercer, A. Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure. J. Vis. Exp. (150), e59580, doi:10.3791/59580 (2019).

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