הערכת התגובה החיסונית הסלולר של זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, שימוש ב Vivo Phagocytosis Assay

מערכות ההגנה החיסוניות מולדת יוצרים את השורה הראשונה של הגנה מפני חיידקים פתוגניים. תגובות אלה ניתן לחלק באופן פונקציונלי לתוך ההורמונאלית וסלולריות מולדת חסינות, אשר שניהם נמצאים מתווך על ידי קולטנים זיהוי התבנית בקידוד germline (PRRs) לחוש פתוגן-הקשורים דפוסי מולקולרית (PAMPs)¹. רבים מן המסלולים איתות ומנגנונים אפקטור של מולדת חסינות נשמרים יונקים, חסרי חוליות, כגון של תולעים נימיות, Caenorhabditis elegans, זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster². זבוב הפירות התפתחה מערכת חזקה ללמוד מארח הגנה מפני מיקרואורגניזמים זיהומיות³. דרוזופילה הוא צייתן גנטית, בקלות ובזול גדלו במעבדות, ויש לו זמן דור קצר. יתר על כן, זבוב הפירות המוצגים ההגנה היעילה ביותר נגד מערך של חיידקים, המאפשר הבחינה של המארח חסינות מפני גורמי מחלה ויראלי, חיידקי, פטרייתי או טפילים.

דרוזופילה immunologists היסטורית מסויימת קדימה מסכי גנטי, הגנום כולו בתיווך RNA הפרעה (RNAi) הקרנה של שורות תאים חרקים, קיימים זנים לעוף מוטנטים לבחון מולדת חסינות – המוביל זיהוי ואפיון של מספר המסלולים החיסונית ההורמונאלית אבולוציונית שנשמרת^4,5,6,7,8. התגובה החיסונית מולדת ההורמונאלית, ניתן לטעון, הכי טוב מאופיין ההגנה החיסונית של זבובי פירות. לאחר ההדבקה, התגובה ההורמונאלית מוביל ייצור ושחרור מערכתית של פפטיד מיקרוביאלית (כח) מולקולות לתוך hemolymph, הדם המקביל בחרקים. מגברים המיוצרים על ידי אגרה מאוד שנשמרת Imd מסלולי איתות. מסלול אגרה זה הומולוגי ל בתרבית של קולטן TLR/IL-1R איתות, מסלול Imd הומולוגי ל הגידול נקרוזה מקדם יונקים-אלפא איתות. ב . דרוזופילה, אגרה איתות הנגרמת על ידי חיידקים גראם חיוביים, פטריות ו viru דרוזופילה Xs^6,9,10 , Imd איתות הנגרמת על ידי חיידקים גראם שליליים^{11 ,12}.

חסינות תאית, המורכב כימוס, melanization ו- phagocytosis של פתוגנים פולשני, שביצעו תאי דם מיוחד הנקרא hemocytes¹³. ישנם שלושה סוגים של hemocytes זבוב הפירות: קריסטל תאים, lamellocytes ו- plasmatocytes¹³. קריסטל תאים, אשר מהווים 5% של hemocytes במחזור של הזחלים, שחרור אנזימים proPhenoloxidase (צע) שמוביל melanization של פתוגנים ורקמות מארח באתרים הפצע. Lamellocytes, אשר לא כלל נמצאים העוברים בריאים או הזחלים, הם תאים חסיד הכומסים חפצים זרים. תאים אלה הם המושרה על pupariation או כאשר הביצים צרעה parasitizing מופקדים הזחלים. Plasmatocytes phagocytic, אשר מהווים 95% של מחזורי hemocytes של הזחלים, כל שנותר hemocytes אצל מבוגרים, לשחק תפקיד רקמת שיפוץ במהלך הפיתוח ולשמש, ראוי לציין, התא אפקטור הראשי של חסינות תאית דרוזופילה .

Phagocytosis קו מיידית וגם קריטיים של ההגנה החיסונית מולדת; חיידקים זה לפרוץ את מחסום האפיתל של המארח במהירות אפף, חוסל על ידי תאי דם phagocytic (לסקירה מקיפה של ביולוגיה של התא של phagocytosis ראה אסמכתא ¹⁴). תהליך זה הוא יזם בעת זיהוי תבניות מקודד germline רצפטורים (PRRs) על hemocytes מזהה את הפתוגן הקשורים דפוסי מולקולרית (PAMPs) של חיידקים. פעם קשור אל המטרות שלהם, PRRs ליזום cascades איתות להוביל להיווצרות של pseudopods דרך אקטין שיפוצים שלד התא. Pseudopods מקיפים תא החיידק, אשר לאחר מכן נבלע, הפנימו לתוך אברון המתהווה, phagosome. חיידקים מושמדים כמו phagosome עובר התהליך של התבגרות phagosome כאשר phagosome הוא הנסחר לכיוון הפנים של hemocyte acidifies דרך סדרה של אינטראקציות עם lysosomes. חוץ גופית ו תא לימודי ביולוגיה בתרבית של תאי העיקרי היה אינסטרומנטלי זיהוי ואפיון הגורמים לווסת phagocytosis, כגון בתרבית של קולטן Fc-גמא ו- C3b קולטנים^15,16. ובכל זאת, היכולת לבצע מסכי בקנה מידה גדול או לימודים ויוו מוגבלים במערכות יונקים.

כאן נציג של assay ויוו עבור phagocytosis ב זבובי פירות למבוגרים, אשר מבוססת על הליך הוצג לראשונה על ידי המעבדה של דוד שניידר 2000¹⁷. המעבדה שניידר הראה כי hemocytes sessile אכילת הכלי הגבי בטן בקלות phagocytose חרוזי פוליסטירן וחיידקים. כדי להמחיש phagocytosis, זבובים מוזרקים עם חלקיקים fluorescently שכותרתו (כגון e. coli המסומנת fluorescein isothiocyanate (e. coli –FITC)), מודגרות במשך 30 דקות לאפשר זמן hemocytes להחריב את החלקיקים, ולאחר מכן הזריקו trypan blue, אשר המרווה את זריחה של חלקיקים לא phagocytosed במהלך תקופת הדגירה. כלי הגבי לעוף ואז עם תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט הפוכה. את העבודה הזו, באמצעות ניסוי פשוט יחסית, הדגימו כי hemocytes phagocytose חיידקים, חרוזים לייטקס, הזה phagocytosis חיידקי יכול להיות מעוכב מראש הזרקת טס עם חרוזים לייטקס, ואת זה לא טס בלי הסלולר והן ההורמונאלית תגובות חיסוניות רגישים אפילו e. coli. וזמינותו שהובאו בדו ח זה מתבסס על העבודה של המעבדה שניידר לכמת phagocytosis ויוו על ידי מדידת עוצמת קרינה פלואורסצנטית של חלקיקים נבלע על ידי כלי הגבי הקשורים hemocytes.

בדומה את הגישה במערכות יונקים, גנטיקאים דרוזופילה השתמשו בתחילה ברמת הגנום RNAi במבחנה מסכי לזיהוי גנים הדרושים עבור התגובה החיסונית הסלולר^{18,19,20 ,21,22,23}. עם זאת, התפתחות וזמינותו phagocytosis ויוו למבוגרים מופעלת ניסויים מעקב יבוצע בקלות אצל בעלי חיים שלמה, ובכך מאפשר לחוקרים לוודא הביולוגי את התפקיד של הגורמים שזוהו במחקרים במבחנה. כזה היה המקרה עם הקולטן transmembrane אוכל, אשר זיהה לראשונה את כל קולטן חיידקי במסך RNAi באמצעות S2 תאים²⁴ מוצג מאוחר יותר כדי לתווך Escherichia coli (e. coli), Enterococcus faecalis, , Staphylococcus aureus (S. aureus) phagocytosis מבוגרים²⁵.

במעבדה מועסקים וזמינותו phagocytosis ויוו מסכי גנטי קדימה ולימודים הגנום כולו האגודה (באמצעות את דרוזופילה גנטי הפניה לוח (DGRP)) לזיהוי הרומן גנים המווסתים phagocytosis ב hemocytes למבוגרים. מחקרים אלה הובילו איפיון קולטני PGRP-SC1A, PGRP-SA²⁶, את שלפוחית תאיים סחר חלבון Rab14²⁷, גלוטמט טרנספורטר פוליפמוס²⁸ו RNA-מחייב חלבון פוקס-1²⁹.

אנו צופים מסכי לעתיד שילוב של phagocytosis ויוו עלול להוביל הזיהוי של גנים נוספים חשובים עבור התגובה החיסונית הסלולר דרוזופילה. המסכים באמצעות וסודרו באופן מלא שורות המפגרים, כגון DGRP או את דרוזופילה סינתטי האוכלוסייה משאבים (DSPR), ניתן לזהות משתנים טבעיים המשפיעים על התפתחות phagocytosis או hemocyte. יתר על כן, הטכניקה בפרשה מינים אחרים של דרוזופילה או בשימוש למשאבי קהילה חדש המסך, כגון האוסף של 250 מינים דרוזופילה , נשמר על ידי נבחרת דרוזופילה מינים מניות מרכז (NDSSC ) בקורנל. ניסויים אלה יכולים להתבצע באמצעות fluorescently-ידי חיידקי או פטרייתי קיר bioparticles זמינים מסחרית או יכול להתבצע באמצעות מספר כלשהו של חיידקי או פטרייתי מינים – סיפק החיידק מבטאת את סמני פלורסנט .