Bir In Vivo fagositoz tahlil kullanarak Drosophila melanogaster, meyve sineği hücresel bağışıklık yanıtı değerlendirirken
Summary
Bu iletişim kuralı bir hücre tanıma ve mikrobiyal enfeksiyonlar Gümrükleme ölçmek için yetişkin Drosophila melanogaster içinde vivo fagositoz tahlil açıklar.
Abstract
Bütün hayvanlarda doğuştan gelen bağışıklık patojenler geniş bir yelpazede karşı acil ve sağlam bir savunma sağlar. Humoral ve hücresel immün yanıt-e doğru doğuştan gelen bağışıklık ana dallar ve birçok bu yanıtları düzenleyen etkenler örümceklerle omurgasızlar ve memeliler arasında korunmuş. Fagositoz, Merkezi bileşeni hücresel doğuştan gelen bağışıklık, bağışıklık sisteminin özel kan hücreleri tarafından yapılır. Meyve sineği Drosophila melanogaster, moleküler mekanizmaları ve fagositoz bütün hayvanlarda fizyolojik etkilerini araştırmak için güçlü bir genetik model olarak ortaya çıkmıştır. Burada parçacık alımı ve imha Drosophila kan hücreleri, hemocytes tarafından ölçmek için bir enjeksiyon tabanlı içinde vivo fagositoz tahlil göstermektedir. Yordamı araştırmacılar tam parçacık konsantrasyonu ve doz, son derece tekrarlanabilir sonuçlar kısa bir miktarda elde etmek mümkün hale kontrolü sağlar. Deneme nicel, gerçekleştirmek, kolay ve ana faktörler için ekran o etkisi patojen tanıma, alımı ve izni için uygulanabilir.
Introduction
Doğuştan gelen bağışıklık savunma patojenik mikroplar karşı savunma ilk satırı oluşturur. Bu yanıtları ikisi de moleküler desenleri (PAMPs) patojen ilişkili1anlamda germline kodlanmış desen tanıma reseptörleri tarafından (PRRs) aracılı humoral ve hücresel doğuştan gelen bağışıklık işlevsel olarak ayrılabilir. Memeliler ve omurgasızlar, Yuvarlak solucanlar, Caenorhabditis elegans ve meyve sineği Drosophila melanogaster2gibi birçok sinyal yollar ve doğuştan gelen bağışıklık efektör mekanizmaları korunmuş. Meyve sineği bulaşıcı mikroorganizmaların3karşı ana savunma eğitim için güçlü bir sistem olarak ortaya çıkmıştır. Drosophila kolay ve ucuz laboratuvarlarda, yetiştirilen genetik olarak uysal ve kısa oluşturma süresi vardır. Ayrıca, meyve sineği mikroplar, ana bilgisayar dokunulmazlık viral, bakteriyel, mantar veya parazit patojenlere karşı incelenmesi etkinleştirme bir dizi karşı son derece etkili savunma sergiler.
Drosophila immunologists tarihsel olarak ileri genetik ekranlar, böcek hücre satırları filtreleme ve doğuştan gelen bağışıklık-önde gelen incelemek için sinek mutant suşları önceden varolan genom çapında RNA-aracılı girişim (RNAi) kullanılan kimlik ve karakterizasyonu birkaç örümceklerle korunmuş humoral bağışıklık yolları4,5,6,7,8. Humoral doğuştan gelen bağışıklık yanıtı, tartışmalı, en iyi meyve sinekleri bağışıklık savunma ile karakterizedir. Enfeksiyon, humoral yanıt üretim ve antimikrobiyal peptid sistemik sürümü (AMP) molekülleri içine hemolymph, kan içinde böcekler eşdeğer yol açar. Amper son derece korunmuş otoyol ve yolları sinyal IMD tarafından üretilmektedir. Toll yolu, sinyal memeli için homolog TLR/IL-1R reseptör ve IMD yolu memeli tümör nekrozis faktör-Alfa sinyal için homolog. Drosophila, otoyol sinyal gram-pozitif bakteriler, mantarlar ve Drosophila X virus6,9,10 tarafından indüklenen olduğu ve IMD sinyal Ayagin Gram-negatif bakteriler11 tarafından indüklenen ,12.
Hücresel bağışıklık, kapsülleme, melanization ve fagositoz invaziv patojenlerin oluşan özel kan hemocytes13denilen hücreler tarafından yürütülmektedir. Hemocytes meyve sineği içinde üç sınıf vardır: Kristal hücreleri, lamellocytes ve plasmatocytes13. Larva dolaşımdaki hemocytes % 5 makyaj, kristal hücrelerin patojenler ve ana bilgisayar doku yara sitelerdeki melanization önde gelen proPhenoloxidase (proPO) enzimler serbest bırakın. Normalde sağlıklı embriyo veya larva bulunmayan, Lamellocytes yabancı nesneler kapsülleyen yapisan hücrelerdir. Bu hücreler üzerine pupariation veya parasitizing arı yumurta larva yatırılan zaman indüklenir. Larva hemocytes ve tüm kalan hemocytes erişkinlerde dolaşan % 95 makyaj, fagositik plasmatocytes geliştirme sırasında remodeling doku bir rol oynamaktadır ve özellikle, Drosophila hücresel bağışıklık ana efektör hücresi olarak hizmet vermektedir.
Fagositoz bir acil ve çok önemli savunma hattı, doğuştan gelen bağışıklık; ana bilgisayar epitel bariyeri mikroplar hızlı bir şekilde sardı ve fagositik kan hücreleri tarafından elimine (hücre biyolojisi fagositoz, kapsamlı bir inceleme için bkz: başvuru 14). Germline kodlanmış örüntü tanıma reseptörleri (PRRs) hemocytes tarihinde patojen tanıması mikroplar moleküler desenleri (PAMPs) ilişkili zaman bu işlemi başlatılır. Bir kez hedeflerine bağlı, PRRs aktin sitoiskeleti remodeling aracılığıyla pseudopods oluşumu neden sinyal cascades başlatın. Pseudopods hangi daha sonra sardı ve doğmakta olan organel, phagosome içselleştirilmiş mikrop, surround. Phagosome hemocyte iç doğru insan ticareti ve etkileşimleri organellerin ile bir dizi acidifies phagosome phagosome olgunlaşma süreci uğrar gibi mikropların yok edilir. Vitro ve hücre memeli Primer hücre biyolojisi çalışmalarında ve fagositoz, memeli Fc-gama reseptör ve C3b reseptörleri15,16gibi düzenleyen faktörler karakterize vesile olmuştur. Yine de, büyük ölçekli ekranları veya içinde vivo çalışmalar yürütme yeteneğini memeli sistemlerinde sınırlıdır.
Burada içinde vivo bir tahlil için ilk David Schneider laboratuvarda 200017tarafından tanıtılan bir yordam temel fagositoz yetişkin meyve sinekleri içinde mevcut. Schneider laboratuvar sesil hemocytes karın sırt gemi kolayca kümelenmiş polistren boncuk ve bakteri phagocytose gösterdi. Fagositoz görselleştirmek için sinekler (örneğin floresein isothiocyanate ile (E. coli –FITC) etiketli E. coli ), fluorescently etiketli parçacıkları ile enjekte edilir parçacıkları, yutmak için hemocytes zaman izin vermek 30 dakika boyunca inkübe ve sonra Kuluçka döneminde değil fagosite parçacıklar Floresans quenches trypan mavi, enjekte. Sinek dorsal damarları sonra ters bir floresan mikroskop kullanarak yansıma. Seminal bu kağıt hemocytes bakteri phagocytose ve lateks boncuklar, bu bakteri fagositoz önceden enjekte edilerek inhibe olabilir gösterdi nispeten basit bir deney kullanarak lateks boncuk ile gider ve bu hem hücresel ve humoral olmadan uçar bağışıklık yanıtı bile E. coliiçin açıktır. Bu raporda sunulan tahlil içinde vivo fagositoz dorsal gemi ilişkili hemocytes tarafından yuttu parçacıklar floresan yoğunluğu ölçme ölçmek için Schneider laboratuvar çalışmalarını kurar.
Benzer şekilde yaklaşım memeli sistemlerinde alınan, Drosophila genetikçileri başlangıçta genom genelinde kullanılan tüp bebek RNAi ekranlar hücresel immün yanıt18,19için,20 gerekli genlerin tanımlamak için ,21,22,23. Ancak, Yetişkin içinde vivo fagositoz tahlil gelişimi izleme denemeleri kolayca böylece biyolojik doğrulamak için araştırmacılar içinde vitro çalışmalarda tespit faktörler rol izin tüm hayvanlarda gerçekleştirilebilmesi etkin. Böyle transmembran reseptör yiyen, ilk24 S2 kullanarak bir RNAi ekranında bakteriyel bir reseptör hücreleri olarak tanımlanan ve Escherichia coli (e.coli), enterokok arabuluculuk için daha sonra gösterilen olduğu faecalistir, ve Staphylococcus aureus (S. aureus) fagositoz yetişkin25.
Laboratuarımızın içinde vivo fagositoz tahlil ileri genetik ekranlar ve genom çapında dernek çalışmaları ( Drosophila genetik başvuru Masası (DGRP) kullanarak) Yetişkin hemocytes fagositoz düzenleyen yeni genlerin tanımlamak için istihdam. Bu çalışmalar için karakterizasyonu reseptörleri PGRP-SC1A ve PGRP-SA26, protein Rab1427, Glutamat ışınlama Polyphemus28ve RNA-bağlayıcı protein Fox-129kaçakçılığı hücre içi vezikül yol açtı.
Biz gelecekte ekranlar içinde vivo fagositoz birleşmeyle Drosophilahücresel bağışıklık yanıtında için önemli ek genler tanımlaması yol açabileceğini tahmin. DGRP veya Drosophila sentetik nüfus kaynak (DSPR), gibi tam olarak sıralı doğuştan hatlarını kullanarak ekranlar fagositoz ya da hemocyte geliştirme etkileyen doğal türevleri tanımlayabilirsiniz. Ayrıca, teknik Drosophila diğer türler içinde kabul veya olabilir ekran yeni topluluk kaynaklarına, ulusal Drosophila tür stok Merkezi (NDSSC tarafından tutulan 250 Drosophila türler topluluğu gibi kullanılan ) Cornell’de. Bu deneyler ticari olarak kullanılabilir fluorescently etiketli bakteri veya duvar mantar bioparticles kullanarak yürütülen olabilir veya bakteriyel veya mantar türleri-mikrop floresan işaretleri ifade sağlanan herhangi bir sayıda kullanarak yapılamaz .
Protocol
Representative Results
Discussion
Piyasada bulunan, fluorescently etiketli parçacıklar fagositoz genel (0.2 µm karboksilat-modified mikroküreler) veya fagositoz mikroplar (fluorescently etiketli ısı – veya kimyasal olarak öldürdü bakteri veya Maya) değerlendirmek için kullanılır. Phagosome olgunlaşma değerlendirmek için araştırmacılar pH nötr asidik olduğu gibi phagolysosome inerse fluoresces pH duyarlı boya ile etiketli parçacıklar seçebilirsiniz. Alternatif olarak, fagositoz, patojen tanıma ve alımı ilk adımlar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Dr Beth Gonzalez ve Dr Aprajita Garg içinde vivo fagositoz deneyleri yürüten destek için teşekkür ederiz. Bir UBV UMD önceden tohum Grant ve UMD NIH T32 eğitim hibeler, hücre ve moleküler biyoloji (SPK) ve ana bilgisayar-patojen etkileşimleri (HPI), bu eser finanse edilmektedir.
Materials
| 0.2μm Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres | Invitrogen | F8810 | Fluorescently-labeled latex beads to test general phagocytic capacity of phagocytes. (~580/~605 nm) Inject a 1:20 dilution in PBS with 5% dye. |
| 5430-10 PicoNozzle Kit | World Precision Instruments | 5430-10 | Holder for 1.0mm pipette |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | E13231 | Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~495/~519 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | E23370 | Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~590/~617 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate | Invitrogen | E2861 | Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm) |
| Needle Pipette Puller | David Kopf Instruments | Model 725 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate for Phagocytosis | Invitrogen | P35361 | Killed E. coli labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-negative bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue. |
| pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis | Invitrogen | A10010 | Killed S. aureus labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-positve bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue. |
| Pneumatic PicoPump PV820 | World Precision Instruments | SYS-PV820 | The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms “TIMED” mode. |
| S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | S23371 | Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~495/~519 nm) |
| S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | S23372 | Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~590/~617 nm) |
| S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Fluorescein conjugate | Invitrogen | E2851 | Killed S. aureus labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~494/~518 nm) |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-3 | Needles for injection. OD = 1.0 mm |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma | T8154 | Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles. |
| ZEISS SteREO Microscope (Discovery.V8) | Zeiss | SteREO Discovery.V8 | Inverted fluorescence microscope for imaging flies. Use a digital camera (example: AxioCam HC camera) and the accompanying software (example: AxioVision 4.7 software) to take pictures. |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | Z23373 | Killed labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~495/~519 nm) |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | Z23374 | Killed labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~590/~617 nm) |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate | Invitrogen | Z2841 | Killed labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~494/~518 nm) |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red | Invitrogen | Z2843 | Killed labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~595/~615 nm) |
References
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124 (4), 783-801 (2006).
- Kim, D. Studying host-pathogen interactions and innate immunity in Caenorhabditis elegans. Disease Models & Mechanisms. 1 (4-5), 205-208 (2008).
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annual Review Immunology. 25, 697-743 (2007).
- Wu, L. P., Choe, K. M., Lu, Y., Anderson, K. V. Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection. Genetics. 159 (1), 189-199 (2001).
- De Gregorio, E., Spellman, P. T., Tzou, P., Rubin, G. M., Lemaitre, B. The Toll and Imd pathways are the major regulators of the immune response in Drosophila. EMBO Journal. 21 (11), 2568-2579 (2002).
- Michel, T., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A., Royet, J. Drosophila Toll is activated by Gram-positive bacteria through a circulating peptidoglycan recognition protein. Nature. 414 (6865), 756-759 (2001).
- Choe, K. M., Werner, T., Stoven, S., Hultmark, D., Anderson, K. V. Requirement for a peptidoglycan recognition protein (PGRP) in Relish activation and antibacterial immune responses in Drosophila. Science. 296 (5566), 359-362 (2002).
- Wu, J., Randle, K. E., Wu, L. P. ird1 is a Vps15 homologue important for antibacterial immune responses in Drosophila. Cellular Microbiology. 9 (4), 1073-1085 (2007).
- Lemaitre, B., Nicolas, E., Michaut, L., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A. The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/Toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults. Cell. 86 (6), 973-983 (1996).
- Zambon, R. A., Nandakumar, M., Vakharia, V. N., Wu, L. P. The Toll pathway is important for an antiviral response in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102 (20), 7257-7262 (2005).
- Lemaitre, B., et al. A recessive mutation, immune deficiency (imd), defines two distinct control pathways in the Drosophila host defense. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 92 (21), 9465-9469 (1995).
- Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection. EMBO Reports. 1 (4), 353-358 (2000).
- Meister, M., Lagueux, M. Drosophilablood cells. Cellular Microbiology. 5 (9), 573-580 (2003).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annual Review Pathology. 7, 61-98 (2012).
- Anderson, R. A., Sando, G. N. Cloning and expression of cDNA encoding human lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase. Similarities to gastric and lingual lipases. Journal of Biological Chemistry. 266 (33), 22479-22484 (1991).
- Ross, G. D., Reed, W., Dalzell, J. G., Becker, S. E., Hogg, N. Macrophage cytoskeleton association with CR3 and CR4 regulates receptor mobility and phagocytosis of iC3b-opsonized erythrocytes. Journal of Leukocyte Biology. 51 (2), 109-117 (1992).
- Elrod-Erickson, M., Mishra, S., Schneider, D. S. Interactions between the cellular and humoral immune responses in Drosophila. Current Biology. 10, 781-784 (2000).
- Ramet, M., Pearson, A. M., Manfruelli, P., Li, X., Koziel, H., Gobel, V. Drosophila Scavenger Receptor CI Is a Pattern Recognition Receptor for Bacteria. Immunity. 15 (6), 1027-1038 (2001).
- Ramet, M., Manfruelli, P., Pearson, A. M., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature. 416 (6881), 644-648 (2002).
- Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N. Drosophila RNAi screen reveals CD36 family member required for mycobacterial infection. Science. 309, 1251-1253 (2005).
- Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309 (5738), 1248-1251 (2005).
- Stuart, L. M., et al. Response to Staphylococcus aureus requires CD36-mediated phagocytosis triggered by the COOH-terminal cytoplasmic domain. Journal of Cell Biology. 170 (3), 477-485 (2005).
- Stroschein-Stevenson, S. L., Foley, E., O’Farrell, P. H., Johnson, A. D. Identification of Drosophila gene products required for phagocytosis of Candida albicans. PLoS Biology. 4 (1), e4 (2006).
- Kocks, C., et al. Eater, a transmembrane protein mediating phagocytosis of bacterial pathogens in Drosophila. Cell. 123 (2), 335-346 (2005).
- Nehme, N. T., et al. Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections. PLoS One. 6 (3), e14743 (2011).
- Garver, L. S., Wu, J., Wu, L. P. The peptidoglycan recognition protein PGRP-SC1a is essential for Toll signaling and phagocytosis of Staphylococcus aureus in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (3), 660-665 (2006).
- Garg, A., Wu, L. P. Drosophila Rab14 mediates phagocytosis in the immune response to Staphylococcus aureus. Cellular Microbiology. 16 (2), 296-310 (2014).
- Gonzalez, E. A., Garg, A., Tang, J., Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P. A glutamate-dependent redox system in blood cells is integral for phagocytosis in Drosophila melanogaster. Current Biology. 23 (22), 2319-2324 (2013).
- Nazario-Toole, A. E., Robalino, J., Okrah, K., Corrada-Bravo, H., Mount, S. M., Wu, L. P. The Splicing Factor RNA-Binding Fox Protein 1 Mediates the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster. Journal of Immunology (Baltimore, Md: 1950). 201 (4), 1154-1164 (2018).
- Guille, M. . Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus and Zebrafish. , (1999).
- Koundakjian, E. J., Cowan, D. M., Hardy, R. W., Becker, A. H. The Zuker collection: a resource for the analysis of autosomal gene function in Drosophila melanogaster. Genetics. 167 (1), 203-206 (2004).
- Horn, L., Leips, J., Starz-Gaiano, M. Phagocytic ability declines with age in adult Drosophila hemocytes. Aging Cell. 13 (4), 719-728 (2014).
- Brennan, C. A., Delaney, J. R., Schneider, D. S., Anderson, K. V. Psidin is required in Drosophila blood cells for both phagocytic degradation and immune activation of the fat body. Current Biology. 17 (1), 67-72 (2007).
- Akbar, M. A., Tracy, C., Kahr, W. H., Kramer, H. The full-of-bacteria gene is required for phagosome maturation during immune defense in Drosophila. Journal of Cell Biology. 192 (3), 383-390 (2011).
