JoVE Journal > Engineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Engineering

Excitatie-Scanning hyperspectrale beeld microscopie om fluorescentie signalen efficiënt te discrimineren

Published: August 22, 2019
doi:
10.3791/59448
, , ,
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering,University of South Alabama, 2Center for Lung Biology,University of South Alabama, 3Department of Pharmacology,University of South Alabama

Summary

Spectrale beeldvorming is uitgegroeid tot een betrouwbare oplossing voor de identificatie en scheiding van meerdere fluorescentie signalen in een enkel monster en kan gemakkelijk signalen van belang onderscheiden van achtergrond of auto fluorescentie. Excitatie-Scanning Hyperspectrale beeldvorming verbetert deze techniek door de benodigde beeldverzamelings tijd te verlagen en tegelijkertijd de signaal-ruis verhouding te verhogen.

Abstract

Verschillende technieken zijn gebaseerd op de detectie van fluorescentie signalen om verschijnselen te identificeren of te bestuderen of om functies te verheldoen. De scheiding van deze fluorescentie signalen bleek omslachtig te zijn tot de opkomst van Hyperspectrale beeldvorming, waarbij fluorescentie bronnen van elkaar kunnen worden gescheiden, evenals van achtergrond signalen en auto fluorescentie (gezien de kennis van hun spectrale handtekeningen). Traditionele Hyperspectrale beeldvorming met emissie Scanning lijdt echter aan trage acquisitie tijden en lage signaal-ruis verhoudingen vanwege de noodzakelijke filtering van zowel excitatie-als emissie licht. Eerder is aangetoond dat excitatie-Scanning Hyperspectrale beeldvorming de benodigde acquisitie tijd vermindert en tegelijkertijd de signaal-ruis verhouding van de verkregen gegevens verhoogt. Met behulp van commercieel verkrijgbare apparatuur, dit protocol beschrijft hoe te monteren, kalibreren, en het gebruik van een excitatie-Scanning hyperspectrale Imaging microscopie systeem voor scheiding van signalen van verschillende fluorescentie bronnen in een enkel monster. Hoewel deze techniek zeer toepasselijk is voor microscopische beeldvorming van cellen en weefsels, kan deze methode ook nuttig zijn voor elk type experiment waarbij fluorescentie wordt toegepast waarbij het mogelijk is om golflengten van excitatie te variëren, inclusief maar niet beperkt tot: chemische beeldvorming, milieutoepassingen, oogzorg, voedsel wetenschap, forensische wetenschappen, medische wetenschap en mineralogie.

Introduction

Spectrale beeldvorming kan op verschillende manieren worden uitgevoerd en wordt aangeduid met verschillende termen1,2,3,4. In het algemeen verwijst spectrale imaging naar gegevens die zijn verkregen in ten minste twee ruimtelijke dimensies en één spectrale dimensie. Multispectrale en Hyperspectrale beeldvorming worden meestal gekenmerkt door het aantal golflengte banden of de spectrumbanden aaneengesloten1. Voor deze toepassing worden hyperspectrale gegevens gedefinieerd als spectrale gegevens die zijn verkregen met aaneengesloten golflengte banden bereikt door afstand van de middelste golflengten, niet minder dan de helft van de volledige breedte bij halve maximum (FWHM) van elk band pass filter dat wordt gebruikt voor excitatie (d.w.z. 5 nm Midden golflengte afstand voor band pass filters met 14-20 nm bandbreedtes). De aaneengesloten aard van de gegevens banden maakt een oversampling van de gegevensset mogelijk, zodat Nyquist-criteria worden nageleefd bij het samplen van het spectrale domein.

Hyperspectrale beeldvorming werd ontwikkeld door NASA in de jaren zeventig en tachtig in combinatie met de eerste Landsat satelliet5,6. Het verzamelen van gegevens uit verschillende aaneengesloten spectrale banden zorgde voor het opwekken van een stralend spectrum van elke pixel. Het identificeren en definiëren van het stralings spectrum van afzonderlijke componenten maakte het mogelijk om niet alleen oppervlakte materialen te detecteren door hun karakteristieke spectra, maar het ook toegestaan om tussenliggende signalen te verwijderen, zoals variaties in het signaal als gevolg van atmosferische omstandigheden. Het concept van het opsporen van materialen met behulp van hun karakteristieke Spectra werd toegepast op biologische systemen in 1996 toen Schröck et al. gebruikte combinaties van vijf verschillende fluor Foren en hun bekende Spectra om gelabelde chromosomen te onderscheiden in een proces dat spectrale karyotypering7. Deze techniek werd uitgewerkt in 2000 door Tsurui et al. voor fluorescentie beeldvorming van weefselmonsters, met behulp van zeven fluorescerende kleurstoffen en enkelvoudige waarde ontleding om de spectrale separatie van elke pixel te bereiken in lineaire combinaties van spectra in de referentie bibliotheek8. Vergelijkbaar met hun externe sensing tegenhangers, kan de bijdrage van elke bekende de worden berekend uit het hyperspectrale beeld, gegeven a priori informatie over het spectrum van elke de.

Hyperspectrale beeldvorming is ook gebruikt op het gebied van landbouw9, astronomie10, biogeneeskunde11, chemische beeldvorming12, milieu-toepassingen13, Eye Care14, Food Science15, Forensische Wetenschappen16,17, medische wetenschap18, mineralogie19, en surveillance20. Een belangrijke beperking van de huidige fluorescentiemicroscoop hyperspectrale beeldvormingssystemen is dat de standaard hyperspectrale beeldvormingstechnologie fluorescentie signalen in smalle banden isoleert met 1) en eerst het excitatie lampje filtert om de monster excitatie te regelen, 2) verdere filtering uitgezonden licht om de fluorescentie-emissie te scheiden in smalle banden die later wiskundig gescheiden kunnen worden21. Het filteren van zowel de excitatie verlichting als de uitgezonden fluorescentie vermindert de hoeveelheid beschikbaar signaal, die de signaal-ruis verhouding verlaagt en lange aanschaf tijden vereist. Het lage signaal en de lange acquisitie tijden beperken de toepasbaarheid van Hyperspectrale beeldvorming als diagnostisch hulpmiddel.

Er is een beeldvormings modaliteit ontwikkeld die gebruik maakt van Hyperspectrale beeldvorming, maar het beschikbare signaal verhoogt, waardoor de benodigde acquisitie tijd21,22wordt verminderd. Deze nieuwe modaliteit, genaamd excitatie-Scanning Hyperspectrale beeldvorming, verwerft spectrale beeldgegevens door de excitatie golflengte te variëren en een breed scala aan uitgezonden licht te verzamelen. Er is al eerder aangetoond dat deze techniek leidt tot een verhoging van de signaal-ruis verhouding in vergelijking met de technieken voor emissie Scanning21,22. De toename van de signaal-ruis verhouding is grotendeels te wijten aan de brede band pass (~ 600 nm) van het geconstateerde emissie licht, terwijl specificiteit wordt geboden door alleen het excitatie lampje te filteren in plaats van de fluorescentie-emissie. Dit maakt het mogelijk alle uitgezonden licht (voor elke excitatie golflengte) om de detector te bereiken21. Bovendien kan deze techniek worden gebruikt om autofluorescentie van exogene etiketten te discrimineren. Bovendien vermindert de mogelijkheid om de acquisitie tijd te verkorten door een verhoogd detecteerbaar signaal het gevaar van fotobleaching en maakt het mogelijk spectrale scans tegen een acquisitie ratio die acceptabel is voor spectrale videobeelden.

Het doel van dit protocol is om te dienen als een gids voor het verzamelen van gegevens voor excitatie-Scanning hyperspectrale beeldvormings microscopie. Bovendien zijn beschrijvingen opgenomen die helpen om het lichtpad en de hardware te begrijpen. Ook beschreven is de implementatie van open-source software voor een excitatie-Scanning hyperspectrale beeld Microscoop. Ten slotte worden beschrijvingen gegeven voor het kalibreren van het systeem naar een NIST-traceerbare standaard, het aanpassen van software-en hardware-instellingen voor nauwkeurige resultaten en het opheffen van het gedetecteerde signaal in bijdragen van afzonderlijke componenten.

Protocol

1. apparaat instellen Lichtbron: Selecteer een breedbandspectrale lichtbron met hoog uitgangsvermogen en hoge collimator (een 300 W XE Arc lamp werd gebruikt voor deze studies). Sluiter (optioneel): Voeg een sluiter toe aan het optische pad om photobleaching voor timelapse-beeldvorming te verminderen. Afstembare filtersysteem: Neem een mechanische tuning-assemblage en dun-film instelbare filter (TFTF) ingesteld om het gewenste golflengte instelbare excitatie bereik (bijv. 360-485 nm) mogelij…

Representative Results

Een aantal belangrijke stappen van dit protocol zijn nodig om te zorgen voor het verzamelen van gegevens die zowel nauwkeurig en verstoken van Imaging en spectrale artefacten. Het overslaan van deze stappen kan resulteren in gegevens die significant lijken, maar niet kunnen worden geverifieerd of gereproduceerd met een ander spectrale beeldvormings systeem, waardoor eventuele conclusies met deze gegevens effectief worden tenietgedaan. Chief onder deze belangrijke stappen is de juiste spec…

Discussion

Het optimale gebruik van een excitatie-Scanning hyperspectrale Imaging set-up begint met de bouw van het lichtpad. Met name de keuze van de lichtbron, filters (instelbaar en dichroïde), filter schakelmethode en camera bepalen het beschikbare spectrum bereik, mogelijke scansnelheid, detector gevoeligheid en ruimtelijke sampling. Mercury Arc-lampen bieden vele pieken van de excitatie golflengte, maar bieden geen platte spectrale uitgang en vereisen een aanzienlijke signaal reductie bij de uitgangen om de spectrale beeldge…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen steun van NSF 1725937, NIH P01HL066299, NIH R01HL058506, NIH S10OD020149, NIH UL1 TR001417, NIH R01HL137030, AHA 18PRE34060163 en het Abraham Mitchell Cancer Research Fund erkennen.

Materials

Airway Smooth Muscle Cells National Disease Research Interchange (NDRI) Isolated from human lung tissues obtained from NDRI Highly autofluorescent, calcium sensitive cells
Automated Shutter Thorlabs Inc. SHB1 Remote-controllable shutter to minimize photobleaching
Automated Stage Prior Scientific H177P1T4 Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection.
Automated Stage Controller (XY) Prior Scientific Proscan III (H31XYZE-US) For interfacing automated stage with computer and joystick
Buffer Made in-house Made in-house 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3
Cell Chamber ThermoFisher Scientific Attofluor Cell Chamber, A7816 Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination
Excitation Filters Semrock Inc. TBP01-378/16 Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88)
Semrock Inc. TBP01-402/16 Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
Semrock Inc. TBP01-449/15 Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
Semrock Inc. TBP01-501/15 Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84)
Semrock Inc. TBP01-561/14 Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83)
Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter Semrock Inc. FF495-Di03 Separates excitation and emission light at 495 nm (>98% reflection between 350-488 nm, >93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78)
Fluorescence Filter Cube Longpass Filter Semrock Inc. FF01 496/LP-25 Allows passage of light longer than 496 nm ( >93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86)
GCaMP Probe Addgene G-CaMP3; Plasmid #22692 A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator
Integrating Sphere Ocean Optics FOIS-1 Used for accurate measurement of wide-angle illumination
Inverted Fluorescence Microscope Nikon Instruments TE2000 Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue.
Mitotracker Green FM ThermoFisher Scientific M7514 Labels mitochondria
NIST-Traceable Calibration Lamp Ocean Optics LS-1-CAL-INT A lamp with a known spectrum for use as a standard
NIST-Traceable Fluorescein ThermoFisher Scientific F36915 For verifying appropriate spectral response of the system
NucBlue ThermoFisher Scientific R37605 Labels cell nuclei
Objective (10X) Nikon Instruments Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105 Useful for large fields of view
Objective (20X) Nikon Instruments Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205 Most often used for tissue samples
Objective (60X) Nikon Instruments Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 Most often used for cell samples
sCMOS Camera Photometrics Prime 95B (Rev A8-062802018) For acquiring high-sensitivity digital images
Spectrometer Ocean Optics QE65000 Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system
Tunable Filter Changer Sutter Instrument Lambda VF-5 Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching
Xenon Arc Lamp Sunoptic Technologies Titan 300HP Lightsource Light source with relatively uniform spectral output
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hagen, N. A., Kudenov, M. W. Review of snapshot spectral imaging technologies. Optical Engineering. 52 (9), 90901 (2013).
  2. Li, Q., He, X., Wang, Y., Liu, H., Xu, D., Guo, F. Review of spectral imaging technology in biomedical engineering: achievements and challenges. Journal of Biomedical Optics. 18 (10), 100901 (2013).
  3. Lu, G., Fei, B. Medical hyperspectral imaging: a review. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 10901 (2014).
  4. Mehta, N., Shaik, S., Devireddy, R., Gartia, M. R. Single-Cell Analysis Using Hyperspectral Imaging Modalities. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (2), 20802 (2018).
  5. Goetz, A. F. H. Three decades of hyperspectral remote sensing of the Earth: A personal view. Remote Sensing of Environment. 113, S5-S6 (2009).
  6. Goetz, A. F. Measuring the Earth from Above: 30 Years(and Counting) of Hyperspectral Imaging. Photonics Spectra. 45 (6), 42-47 (2011).
  7. Schröck, E. Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes. Science. 273 (5274), 494-497 (1996).
  8. Tsurui, H. Seven-color fluorescence imaging of tissue samples based on Fourier spectroscopy and singular value decomposition. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 48 (5), 653-662 (2000).
  9. Lu, R., Chen, Y. R. Hyperspectral imaging for safety inspection of food and agricultural products. SPIE. 3544, 121-134 (1999).
  10. Hege, E. K., O’Connell, D., Johnson, W., Basty, S., Dereniak, E. L. Hyperspectral imaging for astronomy and space surviellance. SPIE. 5159, 380-392 (2004).
  11. Vo-Dinh, T. A hyperspectral imaging system for in vivo optical diagnostics. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 23 (5), 40-49 (2004).
  12. Dorrepaal, R. M., Gowen, A. A. Identification of Magnesium Oxychloride Cement Biomaterial Heterogeneity using Raman Chemical Mapping and NIR Hyperspectral Chemical Imaging. Scientific Reports. 8 (1), 13034 (2018).
  13. Swayze, G. A. Using imaging spectroscopy to map acidic mine waste. Environmental Science & Technology. 34 (1), 47-54 (2000).
  14. Khoobehi, B., Beach, J. M., Kawano, H. Hyperspectral imaging for measurement of oxygen saturation in the optic nerve head. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (5), 1464-1472 (2004).
  15. Gowen, A., O’Donnell, C., Cullen, P., Downey, G., Frias, J. Hyperspectral imaging-an emerging process analytical tool for food quality and safety control. Trends in Food Science & Technology. 18 (12), 590-598 (2007).
  16. Edelman, G., van Leeuwen, T. G., Aalders, M. C. Hyperspectral imaging for the age estimation of blood stains at the crime scene. Forensic Science International. 223 (1), 72-77 (2012).
  17. Edelman, G., Gaston, E., Van Leeuwen, T., Cullen, P., Aalders, M. Hyperspectral imaging for non-contact analysis of forensic traces. Forensic Science International. 223 (1), 28-39 (2012).
  18. Markgraf, W., Feistel, P., Thiele, C., Malberg, H. Algorithms for mapping kidney tissue oxygenation during normothermic machine perfusion using hyperspectral imaging. Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 63 (5), 557-566 (2018).
  19. Boubanga-Tombet, S. Thermal Infrared Hyperspectral Imaging for Mineralogy Mapping of a Mine Face. Remote sensing. 10 (10), 1518 (2018).
  20. Yuen, P. W., Richardson, M. An introduction to hyperspectral imaging and its application for security, surveillance and target acquisition. The Imaging Science Journal. 58 (5), 241-253 (2010).
  21. Favreau, P. F. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19 (4), 046010-046010 (2014).
  22. Favreau, P. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of biomedical optics. 19 (1), 011017-011017 (2014).
  23. Leavesley, S. J. Hyperspectral imaging microscopy for identification and quantitative analysis of fluorescently-labeled cells in highly autofluorescent tissue. Journal of Biophotonics. 5 (1), 67-84 (2012).
  24. Annamdevula, N. S. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
  25. Deshpande, D. A., Walseth, T. F., Panettieri, R. A., Kannan, M. S. CD38/cyclic ADP-ribose-mediated Ca2+ signaling contributes to airway smooth muscle hyper-responsiveness. The FASEB Journal. 17 (3), 452-454 (2003).
  26. Deshpande, D. A. Modulation of calcium signaling by interleukin-13 in human airway smooth muscle: role of CD38/cyclic adenosine diphosphate ribose pathway. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 36-42 (2004).
  27. Guo, M. Cytokines regulate β-2-adrenergic receptor responsiveness in airway smooth muscle via multiple PKA-and EP2 receptor-dependent mechanisms. Biochemistry. 44 (42), 13771-13782 (2005).
  28. Mansfield, J. R., Gossage, K. W., Hoyt, C. C., Levenson, R. M. Autofluorescence removal, multiplexing, and automated analysis methods for in-vivo fluorescence imaging. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41207 (2005).
  29. Mansfield, J. R., Hoyt, C., Levenson, R. M. Visualization of microscopy-based spectral imaging data from multi-label tissue sections. Current Protocols in Molecular Biology. 84 (1), 14-19 (2008).
  30. Bouchard, M. B. Recent advances in catheter-based optical coherence tomography (OCT) have provided the necessary resolution and acquisition speed for high-quality intravascular imaging. Complications associated with clearing blood from the vessel of a living patient have. Journal of Biomedical Optics. 12 (5), 51601 (2007).
  31. Mansfield, J. R. Distinguished photons: a review of in vivo spectral fluorescence imaging in small animals. Current Pharmaceutical Biotechnology. 11 (6), 628-638 (2010).
  32. Levenson, R. M., Mansfield, J. R. Multispectral imaging in biology and medicine: slices of life. Cytometry Part A. 69 (8), 748-758 (2006).
  33. Gammon, S. T., Leevy, W. M., Gross, S., Gokel, G. W., Piwnica-Worms, D. Spectral unmixing of multicolored bioluminescence emitted from heterogeneous biological sources. Analytical Chemistry. 78 (5), 1520-1527 (2006).
  34. . . Spectral Unmixing Plugins. , (2006).
  35. . . Spectral Unmixing of Bioluminescence Signals. , (2006).
  36. Keshava, N., Mustard, J. F. Spectral unmixing. IEEE Signal Processing Magazine. 19 (1), 44-57 (2002).
  37. Deal, J. Identifying molecular contributors to autofluorescence of neoplastic and normal colon sections using excitation-scanning hyperspectral imaging. Journal of Biomedical Optics. 23 (12), (2018).
  38. Microscopy Key, . Microscopy: Key Considerations for Nonlaser Light Sources | Features. BioPhotonics. , (2016).
  39. Chiu, L., Su, L., Reichelt, S., Amos, W. Use of a white light supercontinuum laser for confocal interference-reflection microscopy. Journal of Microscopy. 246 (2), 153-159 (2012).
  40. . . Choosing the best light source for your fluorescence experiment. , (2019).
  41. Beier, H. T., Ibey, B. L. Experimental comparison of the high-speed imaging performance of an EM-CCD and sCMOS camera in a dynamic live-cell imaging test case. PLoS ONE. 9 (1), e84614 (2014).
  42. Tutt, J. Comparison of EM-CCD and scientific CMOS based camera systems for high resolution X-ray imaging and tomography applications. Journal of Instrumentation. 9 (6), P06017 (2014).
  43. Coates, C. New sCMOS vs. current microscopy cameras. Biophotonics International. 18 (5), 24-27 (2011).
  44. Neher, R., Neher, E. Optimizing imaging parameters for the separation of multiple labels in a fluorescence image. Journal of Microscopy. 213 (1), 46-62 (2004).
  45. Deal, J. Hyperspectral imaging fluorescence excitation scanning spectral characteristics of remodeled mouse arteries. SPIE. 10890, 108902M (2019).
  46. Deal, J., Rich, T. C., Leavesley, S. J. Optimizing channel selection for excitation-scanning hyperspectral imaging. SPIE. , 108811B (2019).
  47. Biehlmaier, O., Hehl, J., Csucs, G. Acquisition speed comparison of microscope software programs. Microscopy Research and Technique. 74 (6), 539-545 (2011).
  48. . . Comparison with other microscopy software – Micro-manager. , (2012).

Tags

Excitation-scanningHyperspectral ImagingFluorescence SignalsSpectral Imaging MicroscopySupercontinuum LaserSpinning DiskLaser Scanning Confocal MicroscopeFluorescent LabelsSample PreparationImage AcquisitionImage AnalysisImageJ

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Deal, J., Britain, A., Rich, T., Leavesley, S. Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging Microscopy to Efficiently Discriminate Fluorescence Signals. J. Vis. Exp. (150), e59448, doi:10.3791/59448 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image