وقد أصبح التصوير الطيفي حلاً موثوقاً به لتحديد وفصل إشارات الفلورة المتعددة في عينة واحدة، ويمكن أن يميز بسهولة بين الإشارات ذات الأهمية والخلفية أو الفلورة الذاتية. يحسن التصوير الطيفي الفائق المسح الضوئي على هذه التقنية عن طريق تقليل وقت الحصول على الصور اللازمة مع زيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء في نفس الوقت.
وتعتمد عدة تقنيات على الكشف عن إشارات الفلورة لتحديد الظواهر أو دراستها أو توضيح الوظائف. وقد ثبت أن فصل إشارات الفلورة هذه مرهق حتى ظهور التصوير فوق الطيفي، الذي يمكن فيه فصل مصادر الفلورة عن بعضها البعض وكذلك عن إشارات الخلفية والفلورة الذاتية (نظراً للمعرفة بخصائصها الطيفية التوقيعات). ومع ذلك، فإن التصوير الطيفي الفائق المسحي للانبعاثات التقليدي يعاني من بطء أوقات الاكتساب وانخفاض نسب الإشارة إلى الضوضاء بسبب التصفية الضرورية لكل من الإثارة وضوء الانبعاثات. وقد تبين من قبل أن التصوير الطيفي الفائق المسح يُحدِّد وقت الاكتساب اللازم مع زيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء في البيانات المكتسبة في الوقت نفسه. وباستخدام المعدات المتاحة تجارياً، يصف هذا البروتوكول كيفية تجميع ومعايرة واستخدام نظام تصوير التصوير الطيفي الفائق المسح يُظهر الإثارة لفصل الإشارات عن عدة مصادر فلورسفية في عينة واحدة. في حين أن هذه التقنية تنطبق بشكل كبير على التصوير المجهري للخلايا والأنسجة، إلا أنها قد تكون مفيدة لأي نوع من التجارب التي تستخدم الفلورة التي يمكن فيها تغيير أطوال موجية الإثارة، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر: التصوير الكيميائي، التطبيقات البيئية، ورعاية العيون، وعلوم الأغذية، وعلم الطب الشرعي، والعلوم الطبية، والمعادن.
يمكن إجراء التصوير الطيفي بطرق مختلفة ويشار إليه بعدةمصطلحات1و2و3و4. وبوجه عام، يشير التصوير الطيفي إلى البيانات التي تم الحصول عليها في بعدين مكانيتين على الأقل وبعد طيفي واحد. يتميز التصوير المتعدد الأطياف وفرط الطيفية في أغلب الأحيان بعدد نطاقات الطول الموجي أو ما إذا كانت النطاقات الطيفية متجاورة1. وبالنسبة لهذا التطبيق، تُعرَّف البيانات فوق الطيفية بأنها البيانات الطيفية المكتسبة بنطاقات الطول الموجي المتجاورة التي تتحقق عن طريق المباعدة بين الأطوال الموجية المركزية بما لا يقل عن نصف العرض الكامل عند نصف الحد الأقصى (FWHM) لكل مرشح تمرير شريطي يستخدم للإثارة (أي 5 نانومتر تباعد الطول الموجي مركز لمرشحات النطاق مع 14-20 نانومتر عرض النطاق). وتسمح الطبيعة المتجاورة لنطاقات البيانات بالإفراط في أخذ مجموعة البيانات، مما يكفل استيفاء معايير Nyquist عند أخذ عينات من المجال الطيفي.
وقد تم تطوير التصوير فوق الطيفي من قبل ناسا في 1970s و 1980s جنبا إلى جنب مع أول ساتل لاندسات5,6. وقد أتاح جمع البيانات من عدة نطاقات طيفية متجاورة توليد طيف إشراقة لكل بكسل. إن تحديد وتحديد طيف الإشراقة للمكونات الفردية جعل من الممكن ليس فقط الكشف عن المواد السطحية بواسطة أطيافها المميزة، بل سمح أيضاً بإزالة الإشارات المتداخلة، مثل الاختلافات في الإشارة بسبب الظروف الجوية. وقد طُبق مفهوم الكشف عن المواد باستخدام أطيافها المميزة على النظم البيولوجية في عام 1996 عندما استخدم شروك وآخرون مجموعات من خمسة فلوروفورات مختلفة وأطيافها المعروفة للتمييز بين الكروموسومات المسماة في عملية تسمى [كرّوبي] طيفيّة [كرّووبي]7. وقد تم تفصيل هذه التقنية في عام 2000 من قبل Tsurui وآخرون لتصوير الفلورة من عينات الأنسجة، وذلك باستخدام سبعة أصباغ فلورية وتحلل قيمة فريدة لتحقيق الفصل الطيفي لكل بكسل في تركيبات خطية من الأطياف في المرجع مكتبة8. وعلى غرار نظيراتها في مجال الاستشعار عن بعد، يمكن حساب مساهمة كل فلوروفور معروف من الصورة الفائقة الطيفية، مع إعطاء معلومات مسبقة عن طيف كل فلوروفور.
كما تم استخدام التصوير الطيفي الفائق في مجالات الزراعة9، علم الفلك10، الطب الحيوي11، التصوير الكيميائي12، التطبيقات البيئية13، العناية بالعين14، علوم الأغذية15، علم الطب الشرعي16،17، العلوم الطبية18، علم المعادن19، والمراقبة20. ومن القيود الرئيسية لأنظمة التصوير فوق الطيفي المجهر الفلوري الحالي أن تقنية التصوير الطيفي الفائق الطيفي القياسية تعزل إشارات الفلورة في نطاقات ضيقة بنسبة 1) أولاً تصفية ضوء الإثارة للتحكم في الإثارة العينة، ثم 2) مزيد من تصفية الضوء المنبعث لفصل انبعاث الفلورة إلى نطاقات ضيقة التي يمكن فصلها في وقت لاحق رياضيا21. يؤدي تصفية كل من إضاءة الإثارة والفلورة المنبعثة إلى تقليل مقدار الإشارة المتاحة، مما يقلل من نسبة الإشارة إلى الضوضاء ويتطلب فترات اكتساب طويلة. وتحد الإشارة المنخفضة وفترات الاكتساب الطويلة من إمكانية تطبيق التصوير فوق الطيفي كأداة تشخيصية.
وقد تم تطوير طريقة التصوير التي تستخدم التصوير فوق الطيفي ولكن يعزز الإشارة المتاحة، مما يقلل من وقت الاقتناء اللازم21،22. وتكتسب هذه الطريقة الجديدة، التي تسمى التصوير الطيفي الفائق المسح للإثارة، بيانات الصورة الطيفية عن طريق تغيير طول موجة الإثارة وجمع مجموعة واسعة من الضوء المنبعث. وقد تبين من قبل أن هذه التقنية تسفر عن أوامر من الزيادات في حجم نسبة الإشارة إلى الضوضاء بالمقارنة مع تقنيات مسح الانبعاثات21،22. وتعزى الزيادة في نسبة الإشارة إلى الضوضاء إلى حد كبير إلى النطاق الواسع (~ 600 نانومتر) من ضوء الانبعاثات المكتشف، في حين يتم توفير الخصوصية عن طريق تصفية ضوء الإثارة فقط بدلاً من انبعاث الفلورة. وهذا يسمح لجميع الضوء المنبعث (لكل موجة الإثارة) للوصول إلى كاشف21. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذه التقنية للتمييز الفلورة الذاتية من التسميات الخارجية. وعلاوة على ذلك، فإن القدرة على تقليل وقت الاكتساب بسبب زيادة الإشارة القابلة للكشف تقلل من خطر ابيضاض الصور، كما تسمح بإجراء عمليات مسح طيفي بمعدل اكتساب مقبول للتصوير الطيفي بالفيديو.
والهدف من هذا البروتوكول هو أن يكون بمثابة دليل لاقتناء البيانات من أجل التصوير المجهري للتصوير فوق الطيفي المسحي. بالإضافة إلى ذلك، يتم تضمين الأوصاف التي تساعد على فهم مسار الضوء والأجهزة. كما يرد وصف لتنفيذ برمجيات مفتوحة المصدر للمجهر التصويري الفائق الطيفي المسحي. وأخيراً، يتم توفير أوصاف لكيفية معايرة النظام إلى معيار NIST يمكن تتبعها، وضبط إعدادات البرامج والأجهزة للحصول على نتائج دقيقة، وفك خلط الإشارة المكتشفة في مساهمات من مكونات فردية.
يبدأ الاستخدام الأمثل لإعداد التصوير فوق الطيفي المسح يُظهر ببناء مسار الضوء. وعلى وجه الخصوص، فإن اختيار مصدر الضوء، والمرشحات (القابلة للضبط وثنائية الديكروويك)، وطريقة تبديل الفلاتر، والكاميرا تحدد النطاق الطيفي المتاح، وسرعة المسح المحتملة، وحساسية الكاشف، وأخذ العينات المكانية. ت…
The authors have nothing to disclose.
يود المؤلفون أن يعترفوا بالدعم من NSF 1725937، وNIH P01HL066299، وNIH R01HL058506، وNIH S10OD020149، وNIH UL1 TR001417، وNIH R01HL137030، AHA 18PRE34060163، وصندوق أبراهام ميتشل لبحوث السرطان.
Airway Smooth Muscle Cells | National Disease Research Interchange (NDRI) | Isolated from human lung tissues obtained from NDRI | Highly autofluorescent, calcium sensitive cells |
Automated Shutter | Thorlabs Inc. | SHB1 | Remote-controllable shutter to minimize photobleaching |
Automated Stage | Prior Scientific | H177P1T4 | Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection. |
Automated Stage Controller (XY) | Prior Scientific | Proscan III (H31XYZE-US) | For interfacing automated stage with computer and joystick |
Buffer | Made in-house | Made in-house | 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3 |
Cell Chamber | ThermoFisher Scientific | Attofluor Cell Chamber, A7816 | Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination |
Excitation Filters | Semrock Inc. | TBP01-378/16 | Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88) |
Semrock Inc. | TBP01-402/16 | Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8) | |
Semrock Inc. | TBP01-449/15 | Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8) | |
Semrock Inc. | TBP01-501/15 | Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84) | |
Semrock Inc. | TBP01-561/14 | Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83) | |
Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter | Semrock Inc. | FF495-Di03 | Separates excitation and emission light at 495 nm (>98% reflection between 350-488 nm, >93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78) |
Fluorescence Filter Cube Longpass Filter | Semrock Inc. | FF01 496/LP-25 | Allows passage of light longer than 496 nm ( >93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86) |
GCaMP Probe | Addgene | G-CaMP3; Plasmid #22692 | A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator |
Integrating Sphere | Ocean Optics | FOIS-1 | Used for accurate measurement of wide-angle illumination |
Inverted Fluorescence Microscope | Nikon Instruments | TE2000 | Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue. |
Mitotracker Green FM | ThermoFisher Scientific | M7514 | Labels mitochondria |
NIST-Traceable Calibration Lamp | Ocean Optics | LS-1-CAL-INT | A lamp with a known spectrum for use as a standard |
NIST-Traceable Fluorescein | ThermoFisher Scientific | F36915 | For verifying appropriate spectral response of the system |
NucBlue | ThermoFisher Scientific | R37605 | Labels cell nuclei |
Objective (10X) | Nikon Instruments | Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105 | Useful for large fields of view |
Objective (20X) | Nikon Instruments | Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205 | Most often used for tissue samples |
Objective (60X) | Nikon Instruments | Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 | Most often used for cell samples |
sCMOS Camera | Photometrics | Prime 95B (Rev A8-062802018) | For acquiring high-sensitivity digital images |
Spectrometer | Ocean Optics | QE65000 | Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system |
Tunable Filter Changer | Sutter Instrument | Lambda VF-5 | Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching |
Xenon Arc Lamp | Sunoptic Technologies | Titan 300HP Lightsource | Light source with relatively uniform spectral output |