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Engineering

Microscopia di imaging iperspettrale di eccitazione-scanning per discriminare in modo efficiente i segnali di fluorescenza

Published: August 22, 2019
doi:
10.3791/59448
, , ,
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering,University of South Alabama, 2Center for Lung Biology,University of South Alabama, 3Department of Pharmacology,University of South Alabama

Summary

L’imaging spettrale è diventata una soluzione affidabile per l’identificazione e la separazione di più segnali di fluorescenza in un singolo campione e può facilmente distinguere i segnali di interesse dallo sfondo o dall’autofluorescenza. L’imaging iperspettrale a scansione dell’eccitazione migliora questa tecnica diminuendo il tempo necessario di acquisizione dell’immagine aumentando contemporaneamente il rapporto segnale-rumore.

Abstract

Diverse tecniche si basano sul rilevamento di segnali di fluorescenza per identificare o studiare fenomeni o per chiarire le funzioni. La separazione di questi segnali di fluorescenza è stata dimostrata ingombrante fino all’avvento dell’imaging iperspettrale, in cui le fonti di fluorescenza possono essere separate l’una dall’altra, nonché dai segnali di fondo e dall’autofluorescenza (data la conoscenza del loro spettro spettrale firme). Tuttavia, l’imaging iperspettrale tradizionale a scansione delle emissioni soffre di tempi di acquisizione lenti e bassi rapporti segnale-rumore a causa del necessario filtraggio sia della luce di eccitazione che di emissione. È stato dimostrato in precedenza che l’imaging iperspettrale a scansione eccitazione riduce il tempo di acquisizione necessario aumentando contemporaneamente il rapporto segnale-rumore dei dati acquisiti. Utilizzando apparecchiature disponibili in commercio, questo protocollo descrive come assemblare, calibrare e utilizzare un sistema di microscopia di imaging iperspettrale a scansione di eccitazione per la separazione dei segnali provenienti da diverse sorgenti di fluorescenza in un singolo campione. Sebbene sia altamente applicabile all’imaging microscopico di cellule e tessuti, questa tecnica può essere utile anche per qualsiasi tipo di esperimento che utilizza la fluorescenza in cui è possibile variare le lunghezze d’onda di eccitazione, compresa ma non limitata a: imaging chimico, applicazioni ambientali, cure oculistiche, scienze alimentari, scienze forensi, scienze mediche e mineralogia.

Introduction

L’imaging spettrale può essere eseguito in vari modi ed è indicato da diversi termini1,2,3,4. In generale, l’imaging spettrale si riferisce ai dati acquisiti in almeno due dimensioni spaziali e in una dimensione spettrale. L’imaging multispettrale e iperspettrale si distingue più spesso per il numero di bande di lunghezza d’onda o per il fatto che le bande spettrali siano contigue1. Per questa applicazione, i dati iperspettrali sono definiti come dati spettrali acquisiti con bande di lunghezza d’onda contigue ottenute mediante spaziatura delle lunghezze d’onda centrale non meno della metà dell’intera larghezza a metà massima (FWHM) di ogni filtro passabanda utilizzato per l’eccitazione (cioè 5 nm spaziatura della lunghezza d’onda centrale per i filtri passabanda con larghezze di banda 14-20 nm). La natura contigua delle bande di dati consente un sovracampionamento del set di dati, assicurando che i criteri Nyquist siano soddisfatti durante il campionamento del dominio spettrale.

L’imaging iperspettrale è stato sviluppato dalla NASA negli anni ’70 e ’80 in collaborazione con il primo satellite Landsat5,6. La raccolta di dati da diverse bande spettrali contigue ha permesso la generazione di uno spettro di luminosità di ogni pixel. L’identificazione e la definizione dello spettro di luminosità dei singoli componenti ha permesso non solo di rilevare i materiali di superficie dai loro spettri caratteristici, ma ha anche permesso la rimozione dei segnali intermedi, come le variazioni nel segnale dovute condizioni atmosferiche. Il concetto di rilevare i materiali che utilizzano i loro spettri caratteristici è stato applicato ai sistemi biologici nel 1996, quando Schrock et al. cariotipizzazione spettrale7. Questa tecnica è stata elaborata nel 2000 da Tsurui et al. per l’imaging a fluorescenza di campioni di tessuto, utilizzando sette coloranti fluorescenti e decomposizione del valore singolare per ottenere la separazione spettrale di ogni pixel in combinazioni lineari di spettri nel riferimento libreria8. Simile alle loro controparti di telerilevamento, il contributo di ogni fluoroforo noto può essere calcolato dall’immagine iperspettrale, date a priori informazioni dello spettro di ogni fluoroforo.

L’imaging iperspettrale è stato utilizzato anche nei settori dell’agricoltura9, astronomia10, biomedicina11, imaging chimico12, applicazioni ambientali13, cura degli occhi14, scienza alimentare15, scienza forense16,17, scienza medica18, mineralogia19, e sorveglianza20. Una limitazione fondamentale degli attuali sistemi di imaging iperspettrale al microscopio a fluorescenza è che la tecnologia di imaging iperspettrale standard isola i segnali di fluorescenza in bande strette di 1) filtrando prima la luce di eccitazione per controllare l’eccitazione del campione, quindi 2) ulteriore filtraggio emesso luce per separare l’emissione di fluorescenza in bande strette che possono poi essere separate matematicamente21. Filtrare sia l’illuminazione di eccitazione che la fluorescenza emessa riduce la quantità di segnale disponibile, che riduce il rapporto segnale-rumore e richiede lunghi tempi di acquisizione. Il segnale basso e i lunghi tempi di acquisizione limitano l’applicabilità dell’imaging iperspettrale come strumento diagnostico.

È stata sviluppata una modalità di imaging che fa uso di imaging iperspettrale ma aumenta il segnale disponibile, riducendo così il tempo di acquisizione necessario21,22. Questa nuova modalità, chiamata imaging iperspettrale a scansione eccitazione, acquisisce dati di immagine spettrale variando la lunghezza d’onda dell’eccitazione e raccogliendo un’ampia gamma di luce emessa. È stato dimostrato in precedenza che questa tecnica produce ordini di grandezza in aumento del rapporto segnale-rumore rispetto alle tecniche di scansione delle emissioni21,22. L’aumento del rapporto segnale-rumore è in gran parte dovuto all’ampio passaggio a banda (600 nm) della luce di emissione rilevata, mentre la specificità è fornita filtrando solo la luce di eccitazione invece dell’emissione di fluorescenza. Questo permette a tutta la luce emessa (per ogni lunghezza d’onda di eccitazione) di raggiungere il rivelatore21. Inoltre, questa tecnica può essere utilizzata per discriminare l’autofluorescenza dalle etichette esogene. Inoltre, la capacità di ridurre il tempo di acquisizione dovuto a un maggiore segnale rilevabile riduce il pericolo di fotosbiancamento e consente scansioni spettrali a un tasso di acquisizione accettabile per l’imaging video spettrale.

L’obiettivo di questo protocollo è quello di fungere da guida all’acquisizione dei dati per la microscopia dell’imaging iperspettrale a scansione di eccitazione. Inoltre, sono incluse descrizioni che aiutano a comprendere il percorso della luce e l’hardware. Viene inoltre descritta l’implementazione di software open source per un microscopio di imaging iperspettrale a scansione di eccitazione. Infine, vengono fornite descrizioni su come calibrare il sistema a uno standard tracciabile dal NIST, regolare le impostazioni software e hardware per ottenere risultati accurati e annullare il mixdelo del segnale rilevato in contributi da singoli componenti.

Protocol

1. Configurazione del dispositivo Sorgente luminosa: selezionare una fonte di luce spettrale a banda larga con potenza elevata e collisione elevata (una lampada ad arco Xe da 300 W è stata utilizzata per questi studi). Otturatore (opzionale): aggiungere un otturatore al percorso ottico per ridurre il fotosbleaching per l’imaging time-lapse. Sistema di filtro regolabile: incorporare un gruppo di accordatura meccanica e un filtro regolabile a pellicola sottile (TFTF) impostato per consentire …

Representative Results

Diversi passaggi importanti da questo protocollo sono necessari per garantire la raccolta di dati accurati e privi di artefatti di imaging e spettrali. Se si ignorano questi passaggi, è possibile che i dati che appaiono significativi ma non possano essere verificati o riprodotti con qualsiasi altro sistema di imaging spettrale, annullando in modo efficace tutte le conclusioni fatte con tali dati. Principale tra questi importanti passi è la corretta correzione dell’uscita spettrale (sezi…

Discussion

L’uso ottimale di un set-up di imaging iperspettrale a scansione eccitazione inizia con la costruzione del percorso luminoso. In particolare, la scelta della sorgente luminosa, i filtri (regolabili e dicroscopici), il metodo di commutazione dei filtri e la fotocamera determinano la gamma spettrale disponibile, la possibile velocità di scansione, la sensibilità del rivelatore e il campionamento spaziale. Le lampade ad arco Mercury offrono molti picchi di lunghezza d’onda di eccitazione, ma non forniscono un’uscita spett…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori vorrebbero riconoscere il supporto di NSF 1725937, NIH P01HL066299, NIH R01HL058506, NIH S10OD020149, NIH UL1 TR001417, NIH R01HL137030, AHA 18334060163, e il Fondo Di Abraham Mitchell.

Materials

Airway Smooth Muscle Cells National Disease Research Interchange (NDRI) Isolated from human lung tissues obtained from NDRI Highly autofluorescent, calcium sensitive cells
Automated Shutter Thorlabs Inc. SHB1 Remote-controllable shutter to minimize photobleaching
Automated Stage Prior Scientific H177P1T4 Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection.
Automated Stage Controller (XY) Prior Scientific Proscan III (H31XYZE-US) For interfacing automated stage with computer and joystick
Buffer Made in-house Made in-house 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3
Cell Chamber ThermoFisher Scientific Attofluor Cell Chamber, A7816 Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination
Excitation Filters Semrock Inc. TBP01-378/16 Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88)
Semrock Inc. TBP01-402/16 Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
Semrock Inc. TBP01-449/15 Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
Semrock Inc. TBP01-501/15 Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84)
Semrock Inc. TBP01-561/14 Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83)
Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter Semrock Inc. FF495-Di03 Separates excitation and emission light at 495 nm (>98% reflection between 350-488 nm, >93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78)
Fluorescence Filter Cube Longpass Filter Semrock Inc. FF01 496/LP-25 Allows passage of light longer than 496 nm ( >93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86)
GCaMP Probe Addgene G-CaMP3; Plasmid #22692 A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator
Integrating Sphere Ocean Optics FOIS-1 Used for accurate measurement of wide-angle illumination
Inverted Fluorescence Microscope Nikon Instruments TE2000 Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue.
Mitotracker Green FM ThermoFisher Scientific M7514 Labels mitochondria
NIST-Traceable Calibration Lamp Ocean Optics LS-1-CAL-INT A lamp with a known spectrum for use as a standard
NIST-Traceable Fluorescein ThermoFisher Scientific F36915 For verifying appropriate spectral response of the system
NucBlue ThermoFisher Scientific R37605 Labels cell nuclei
Objective (10X) Nikon Instruments Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105 Useful for large fields of view
Objective (20X) Nikon Instruments Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205 Most often used for tissue samples
Objective (60X) Nikon Instruments Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 Most often used for cell samples
sCMOS Camera Photometrics Prime 95B (Rev A8-062802018) For acquiring high-sensitivity digital images
Spectrometer Ocean Optics QE65000 Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system
Tunable Filter Changer Sutter Instrument Lambda VF-5 Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching
Xenon Arc Lamp Sunoptic Technologies Titan 300HP Lightsource Light source with relatively uniform spectral output
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References

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Deal, J., Britain, A., Rich, T., Leavesley, S. Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging Microscopy to Efficiently Discriminate Fluorescence Signals. J. Vis. Exp. (150), e59448, doi:10.3791/59448 (2019).
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