מבצע ספקטרוסקופיית על חלקיקי פלמונית עם מיקרוסקופ ניגוד מבוסס שידור מסוג Nomarski הפרעות דיפרנציאליות

מאז שנות השמונים, מיקרוסקופ הפרעות הדיפרנציאליות (DIC) הוצג בעיקר כשיטת דימות חשובה השמורה לאובייקטים מיקרוקשקשים בתוך המדעים הביולוגיים. עם זאת, במהלך התפתחותו בשנות ה-50 וה-60, היא נועדה להיות טכניקה של מדעי החומרים¹. עם הפיתוחים האחרונים במדעי החומרים הקשורים לחלקיקי פלמונית, התרחש עניין מוגבר באפיון חומרים עם מיקרוסקופ אופטי.

טכניקות אופטיות רבות זמינות בהחלט עבור אפיון ננו (למשל, שדה חשוך, ברייטפילד, אור מקוטב, זריחה, וכו ‘). השדה האפל פופולרי מאוד במחקר ננו-חלקיק, אבל הוא מסתמך אך ורק על אוסף של פיזור ומספק מידע מוגבל על דגימות מורכבות². הקרינה הפלואורסצנטית יכול להיות שימושי, אבל רק עם דגימות כי האור או זה יכול להיות מוכתם כראוי. מיקרוסקופ DIC יש מספר תכונות העושות את זה כלי רב ערך לניתוח של חלקיקים. היתרונות הבולטים ביותר של DIC בהשוואה לשיטות אחרות ולגבי חלקיקי פלמונית הם: אין צורך בצביעת מדגם, אין השפעות ההילה, עומק שדה רדוד ורזולוציה גבוהה לרוחב³. DIC כולל עוצמות נוספות החשובות לחקר הפלמונית ננו-חלקיק. קודם כל, שני שדות הפולריזציה הטבועים והאנכיים נמצאים, וניתן למדוד אותם בו למטרות ספקטרוסקופיה². שנית, האות מקוטב של חלקיקי חלקיקים לא נלכד בתמונה הסופית², אשר יכולה להיות סיבה לדאגה רצינית במדידות בשדה הכהה ספקטרוסקופיית.

מטרתה של מאמר זה היא לספק מתודולוגיה ברורה לשימוש במיקרוסקופיה DIC של נוארסקי משודרים לביצוע ספקטרוסקופיה על חלקיקי פלמונית. למרות DIC היא טכניקה רבת עוצמה אשר ניתן להחיל על חומרים מגוונים מאוד, היא גם טכניקה הדורשת מיומנות גדולה והבנה כדי להפעיל אותו כראוי כאשר הדמיה חלקיקים. מיקרוסקופיה DIC מבוססת שידור יש מסלול אור מורכב¹ שייבדק רק בקצרה כאן. הרכבת האופטית של DIC מוצגת באיור 1. אור מועבר דרך המיקרוסקופ על ידי הראשון עובר דרך מקטפה ומנסרה הקרן הפיצול Nomarski לפני ההתמקדות על ידי הקבל על המטוס לדוגמה. לאחר שעבר דרך המטרה, האור נתקל בקרן-שילוב של פריזמה Nomarski ומנתח לפני היציאה לגלאי. שני מקטני הקיטוב והפריזנוארסקי הינם קריטיים להיווצרות הדימוי הDIC, והינם אחראים להפקת שדות הפולריזציה האורתוגונתיים של DIC¹. עבור הקורא המעוניין לדעת יותר על עקרונות העבודה והנתיב האופטי של מיקרוסקופים DIC של נוארסקי, או ההבדלים בין נוארסקי DIC וסגנונות אחרים של DIC, עיין בחשבונות אחרים הנכתבים בנושאים הבאים^{1, ד ,} מיכל ^{5 ,} מיכל בן ^{6 , 7}. לאחר מכן

חשוב באותה מידה להבין את האופי הבסיסי של חלקיקי הפלמונית לפני שמנסים לבצע ספקטרוסקופיה עליהם, בין אם מדובר בנוארסקי DIC, בשדה החשוך או בכל טכניקה מיקרוסקופית אחרת. בתחום הפלמונניקס, חלקיקי חלקיקים מוגדרים כחלקיקים עם ממדים בקנה מידה של 10-100 ננומטר^8,9. חלקיקים יכולים לקחת על צורות רבות (למשל, כדורים, מוטות, כוכבים, מטומטם, וכו ‘), ואת רוב התכונות החשובות שלהם נובעים אינטראקציות עם אור אולטרה סגול-גלוי ליד טווח אינפרא אדום של הספקטרום האלקטרומגנטי. המונח “פלמונית” אינו מוגבל לחלקיקים¹⁰; עם זאת, כאשר דנים חלקיקים, הוא משמש התייחסות מקומי פלמון משטח תהודה (LSPR). LSPR היא תופעה שבה אלקטרונים ההולכה ב ננו-חלקיק נדנוד בשל האינטראקציה עם הקולון עם קרינה אלקטרומגנטית של להקה בתדר מאוד ספציפי וצרה יחסית⁸. באותם תדרים, חלקיקים פלמונית התערוכה הגדילו את ספיגת האור ופיזור האורות, מה שהופך אותם להיות נצפה עם מיקרוסקופ אופטי. במקרים רבים, מעדיפים להתבונן חלקיקים תוך הצבת מסננים bandpass לפני העבה², כדי לשפר את הניגודיות הדמיה כדי לחסל את האור שנכשל לגרום לאפקט LSPR. שימוש במסננים גם מאפשר לבצע ניסויים ספקטרוסקופית חלקיקים בודדים.

התנהגות אופטית הקשורה ל-LSPR תלויה מאוד בגודל ובצורה של חלקיקי החלקיקים, והיא יכולה להיחקר עם טכניקות רבות של מיקרוסקופ אופטי. עם זאת, כדי לפענח מידע כיוון של חלקיקים פלמונית עם הצורה אניסוטרופי (כלומר, לא כדורי), יש צורך להשתמש בקיטוב של השדה האור. על-ידי סיבוב בזהירות של שדה הקיטוב או המצע לדוגמה בקפיצות קטנות, ניתן לנטר את תכונות הספקטרוסקופיות תלויי האוריינטציה של חלקיקים בודדים. סיבוב ופולריזציה יכול גם לסייע בקביעה אם תכונה ספקטרלית בשל תנודה בסדר קשר קואורדינטיבי או גבוה יותר של אלקטרונים השטח של ננו-חלקיק. עם זאת, במקרה של איזוטרופי (כלומר, כדורי) חלקיקי חלקיקים, הפרופיל הספקטרלי נותר במהותו ללא שינוי בעת סיבוב המדגם תחת אור מקוטב.

כאשר מתבוננים דרך מיקרוסקופ DIC (איור 2), לחלקיקים יש דיסק אוורירי עם מראה לבן ושחור של עופרת-יצוקה כנגד רקע אפור. חלקיקים כדוריים ישמרו זה מראה תחת סיבוב עם שינוי של מסנני bandpass; עם זאת, החלקיקים ייעלמו בהדרגה מן התצוגה כמו אורך הגל המרכזי של הפילטר הופך להיות מופרד עוד יותר הספרה היחידה של LSPR הספירה של הדור¹¹. הופעתו של nanorods יכול לשנות באופן דרמטי למדי כפי שהם מסובבים². Nanorods יש שתי להקות lspr עם התנהגות קשר קואורדינטיבי, המיקום של אשר מבוססים על הממדים הפיזיים של nanorods. כאשר ציר האורך של nanorod מונחה במקביל לאחד השדות הפולריזציה DIC, הדיסק האוורירי יופיע כולו לבן או כל שחור אם הוא מוצג עם מסנן מעבר בנדנה המשויך לאורך הגל זה LSPR. לאחר סיבוב המדגם 90 °, זה יהיה לקחת על הצבע הנגדי. לחילופין, מאז ציר רוחבי של nanorod ניצב לציר האורך, המוט ייקח על הצבע המנוגד בעת מעבר בין מסננים התואמים את אורכי גל LSPR עבור שני הצירים. בכיוונים אחרים והגדרות מסנן, nanorods יופיע יותר כמו כדורים, הצגת מגוון רחב של דפוסי הצללה של דיסק אוורירי. עבור nanorods עם ציר רוחבי < 25 ננומטר, זה יכול להיות קשה לזהות את האות ב-אורך הגל של LSPR באמצעות מיקרוסקופ DIC.

כדי לבצע ספקטרוסקופיית חלקיקים בודדים, חשוב להשתמש ברכיבים האופטיים הנכונים וליישר אותם כהלכה. יש להשתמש במטרה לבצע מיקרוסקופ DIC. עבור ניסויים חלקיקים בודדים, 80 x או 100x יעדי הנפט הם אידיאליים. נוארסקי מהפריזאים בדרך כלל מגיעים בשלושה זנים: סטנדרטי, ניגודיות גבוהה ורזולוציה גבוהה. הסוג האידיאלי תלוי מאוד במטרת הניסוי ובגודל של חלקיקי חלקיקים. הפריסמות הרגילות הן בסדר לניסויים רבים; אבל כאשר עובדים עם חלקיקים קטנים יותר (< 50 ננומטר), מפריזחדות גבוהה יכול להועיל, מאז ניגודיות החלקיקים פוחתת כאשר החלקיקים יורדים בגודל¹¹. התאמת הניגודיות DIC מושגת על-ידי סיבוב מקטפה או על-ידי תרגום אחד מהפריזמות הDIC, בהתאם למותג המיקרוסקופ או לדגם⁶.

לאחר הגדרת התאורה של קולר והגדרות הקיטוב, חיוני שלא לקרוא הגדרות אלה בלבד בעת איסוף נתוני ספקטרוסקופיה. יתרה מזאת, יש לשמור על אות רקע ממוצע קבוע בכל עת במהלך איסוף הנתונים, גם בעת מעבר בין מסננים והגדרות זווית. ערך הרקע האידיאלי בפועל תלוי בטווח הדינמי של המצלמה המדעית, אך באופן כללי, הרקע אמור להיות בטווח של 15%-40% מרמת הזיהוי המירבית של המצלמה. זה מפחית את הסבירות של השבת חיישן המצלמה תוך הפיכת ניגודיות החלקיקים אופטימלית. לאיסוף נתוני ספקטרוסקופיית, יש צורך לעבוד עם מצלמה מדעית הלוכד תמונות בשחור-לבן, בניגוד למצלמת צבע.

הכנה לדוגמה היא היבט קריטי נוסף של חלקיקי פלמונית הדמיה. הכרחי שמפעילים של מיקרוסקופ DIC מבינים את המאפיינים האופטיים של המדגם ושל מצע המדגם. “ניקוי מראש” זכוכית מיקרוסקופ אינו מוכן מספיק עבור חלקיקי הדמיה, וזה חייב להיות מחדש כראוי ניקה לפני לדוגמה התצהיר כדי להבטיח התבוננות ללא השגחה של המדגם. פרוטוקולי ניקוי רבים עבור שקופיות מיקרוסקופ תועדו בעבר¹², אבל זה לא צעד שבדרך כלל מדווח במחקרים ניסיוניים.

לבסוף, שיטות ניתוח נתונים הן הרכיב הסופי לספקטרוסקופיית חלקיקים בודדים. את העוצמות המרביות והמינימליות של כל ננו-חלקיק יש למדוד, כמו גם את ממוצע הרקע המקומי. חלקיקים של עניין צריך להיות ממוקם באזורים ללא שרידים ברקע, פגמים במצע, או תאורה מחוספס. שיטה אחת לקביעת פרופיל ספקטרלי של ננו-חלקיק היא על ידי חישוב ניגודיות החלקיקים בכל אורך הגל, באמצעות המשוואה מתחת^11,13,14,15:

לחילופין, ניתן לפצל את הספקטרום של חלקיק יחיד לרכיבי האות המרביים והמינימליים הבודדים, המייצגים את שני השדות הפולריזציה של DIC, ובכך מציגים את שני הספקטרום התלוי-בו של המנהל, דרך שתי המשוואות: