Spectroscopie d’exécution de nanoparticules plasmoniques avec microscopie de contraste de type Nomarski à base de transmission

Depuis les années 1980, la microscopie de contraste de brouillage différentiel (DIC) a été largement considérée comme une méthode d’imagerie importante réservée aux objets à microéchelle dans les sciences biologiques. Cependant, au cours de son développement dans les années 1950 et 1960, il a été conçu comme une technique pour la science des matériaux¹. Avec les récentes avancées dans les sciences matérielles liées aux nanoparticules plasmoniques, un intérêt accru dans la caractérisation des matériaux avec la microscopie optique a eu lieu.

De nombreuses techniques optiques sont certainement disponibles pour la caractérisation des nanomatériaux (par exemple, champ sombre, champ clair, lumière polarisée, fluorescence, etc.). Champ sombre est largement populaire dans la recherche de nanoparticles, mais il repose uniquement sur la collecte de dispersion et fournit des informations limitées sur les échantillons complexes². La fluorescence peut être utile, mais seulement avec des échantillons qui luminesce ou qui peuvent être correctement colorés. La microscopie DIC a plusieurs traits qui en font un outil précieux pour l’analyse des nanoparticules. Les avantages les plus fréquemment énoncés de DIC par rapport à d’autres méthodes et en ce qui concerne les nanoparticules plasmiques sont: aucune coloration d’échantillon requise, aucun effet de Halo, profondeur de champ peu profonde, et haute résolution latérale³. DIC a des atouts supplémentaires qui sont précieux pour la recherche de nanoparticles plasmoniques. Tout d’abord, deux champs de polarisation inhérente et orthogonale sont présents, et ils peuvent être mesurés simultanément à des fins de spectroscopie². Deuxièmement, le signal dépolarisé des nanoparticules n’est pas capturé dans l’image finale², ce qui peut être une cause sérieuse de préoccupation dans les mesures de spectroscopie de champ sombre.

Le but de cet article est de fournir une méthodologie claire pour l’utilisation de la microscopie à lumière transmise Nomarski DIC pour effectuer la spectroscopie sur les nanoparticules plasmoniques. Bien que DIC soit une technique puissante qui peut être appliquée à des matériaux très variés, c’est aussi une technique qui nécessite une grande habileté et la compréhension pour l’utiliser correctement lors de l’imagerie des nanoparticules. La microscopie de Nomarski DIC basée sur la transmission a une trajectoire lumineuse complexe¹ qui ne sera que brièvement examinée ici. Le train optique de DIC est affiché dans la figure 1. La lumière est transmise par le microscope en passant d’abord par un polariseur et un prisme de Nomarski de fractionnement de faisceau avant d’être concentré par le condenseur sur le plan d’échantillonnage. Après avoir traversé l’objectif, la lumière rencontre un prisme de Nomarski combinant faisceau et un analyseur avant de sortir au détecteur. Les deux polariseurs et prismes de Nomarski sont essentiels à la formation de l’image DIC et sont responsables de la production de deux champs de polarisation orthogonale de DIC¹. Pour le lecteur intéressé à en savoir plus sur les principes de travail et le chemin optique des microscopes DIC Nomarski, ou les différences entre Nomarski DIC et d’autres styles de DIC, s’il vous plaît se référer à d’autres comptes bien écrits sur ces sujets^1, le ^{4 , 5} la plupart des ^, le ^{6 ,} le ⁷.

Il est également important de comprendre la nature de base des nanoparticules plasmiques avant d’essayer d’effectuer la spectroscopie sur eux, que ce soit avec Nomarski DIC, champ sombre, ou toute autre technique de microscopie. Dans le domaine des Plasmonics, les nanoparticules sont définies comme des particules avec des dimensions sur l’échellede 10-100 nm^8,9. Les nanoparticules peuvent prendre de nombreuses formes (p. ex. sphères, tiges, étoiles, haltères, etc.), et la plupart de leurs propriétés importantes proviennent d’interactions avec la lumière dans la gamme ultraviolette visible-proche infrarouge du spectre électromagnétique. Le terme «plasmonique» n’est pas limité aux nanoparticules¹⁰; Cependant, lors de la discussion des nanoparticules, il est utilisé en référence à la résonance localisée de Plasmon de surface (LSPR). LSPR est un phénomène dans lequel les électrons de conduction dans une nanoparticules oscillent en raison d’une interaction coulombique avec le rayonnement électromagnétique d’une bande de fréquences très spécifique et relativement étroite⁸. À ces mêmes fréquences, les nanoparticules plasmoniques présentent une absorption et une dispersion accrues de la lumière, ce qui les rend observables avec la microscopie optique. Dans de nombreux cas, il est préférable d’observer les nanoparticules tout en plaçant les filtres passe-bande avant le condenseur², pour améliorer le contraste d’imagerie et d’éliminer la lumière qui ne parvient pas à induire l’effet LSPr. L’utilisation de filtres permet également d’effectuer des expériences de spectroscopie à particules uniques.

Le comportement optique lié à LSPR dépend fortement de la taille et de la forme des nanoparticules, et il peut être étudié avec de nombreuses techniques de microscopie optique. Cependant, afin de déchiffrer les informations d’orientation des nanoparticules plasmoniques avec une forme anisotrope (c.-à-d. non sphérique), il est nécessaire d’utiliser la polarisation du champ lumineux. En tournant soigneusement le champ de polarisation ou le substrat de l’échantillon à petits incréments, il est possible de surveiller les propriétés spectroscopiques dépendantes de l’orientation des nanoparticules individuelles. La rotation et la polarisation peuvent également aider à déterminer si une caractéristique spectrale est due à une oscillation dipolaire ou supérieure des électrons de surface de la nanoparticle. Toutefois, dans le cas des nanoparticules isotropes (c.-à-d. sphériques), le profil spectral reste essentiellement inchangé lors de la rotation de l’échantillon sous lumière polarisée.

Lorsqu’ils sont vus à l’aide d’un microscope DIC (figure 2), les nanoparticules ont un disque aéré avec un aspect blanc et noir coulé dans l’ombre contre un fond gris. Les nanoparticules sphériques conserveront cette apparence sous rotation et avec le changement des filtres passe-bande; Cependant, les particules disparaîtront graduellement de la vue car la longueur d’onde centrale du filtre se sépare de la seule longueur d’onde dipolaire de la sphère¹¹. L’apparition de nanotiges peut changer tout à fait radicalement car ils sont pivotés². Les nanorods ont deux bandes LSPR avec un comportement dipolaire, dont l’emplacement est basé sur les dimensions physiques des nanorods. Lorsque l’axe longitudinal d’un nanotige est orienté parallèlement à l’un des champs de polarisation dic, le disque aéré apparaîtra tout blanc ou tout noir s’il est vu avec un filtre passe-bande associé à cette longueur d’onde LSPr. Après la rotation de l’échantillon 90 °, il prendra sur la couleur opposée. Alternativement, puisque l’axe transversal d’un nanotige est perpendiculaire à l’axe longitudinal, la tige prendra sur la couleur opposée lors de la commutation entre les filtres qui correspondent aux longueurs d’onde LSPr pour les deux axes. Dans d’autres orientations et paramètres de filtrage, les nanotiges apparaîtront plus comme des sphères, présentant une variété de motifs de disques aérés en fonte d’ombres. Pour les nanotiges avec un axe transversal < 25 nm, il peut être difficile de détecter le signal à la longueur d’onde de cette LSPr à l’aide de la microscopie dic.

Pour effectuer une spectroscopie à une seule particule, il est important d’utiliser les composants optiques corrects et de les aligner correctement. Un objectif capable de microscopie DIC doit être utilisé. Pour les expériences à particules uniques, les objectifs d’huile 80x ou 100X sont idéaux. Les prismes de Nomarski DIC viennent ordinairement en trois variétés: standard, contraste élevé et haute résolution. Le type idéal dépend fortement du but de l’expérience et de la taille des nanoparticules. Prismes standard sont très bien pour de nombreuses expériences; mais lorsque l’on travaille avec des nanoparticules plus petites (< 50 nm), les prismes à contraste élevé peuvent être bénéfiques, car le contraste des particules diminue à mesure que les particules diminuent en taille¹¹. Le réglage du contraste DIC est réalisé soit en tournant un polariseur, soit en traduisant l’un des prismes DIC, selon la marque du microscope ou le modèle⁶.

Après avoir réglage de l’éclairage Kohler et des paramètres de polariseur, il est essentiel de ne pas réajuster ces paramètres lors de la collecte des données de spectroscopie. En outre, un signal d’arrière-plan moyen constant doit être maintenu à tout moment pendant la collecte des données, même en cas de commutation entre les filtres et les réglages d’angle. La valeur de fond idéale réelle dépend de la plage dynamique de la caméra scientifique, mais en général, l’arrière-plan doit être dans la plage de 15% – 40% du niveau de détection maximum de la caméra. Cela réduit la probabilité de saturer le capteur de la caméra tout en permettant un contraste optimal des particules. Pour collecter des données de spectroscopie, il est nécessaire de travailler avec une caméra scientifique qui capture des images en noir et blanc, par opposition à une caméra couleur.

La préparation des échantillons est un autre aspect critique de l’imagerie des nanoparticules plasmoniques. Il est impératif que les opérateurs de microscopie DIC comprennent les propriétés optiques de l’échantillon et le substrat de l’échantillon. Le verre de microscope «pré-nettoyé» n’est pas suffisamment préparé pour l’imagerie des nanoparticules, et il doit être correctement nettoyé avant le dépôt de l’échantillon pour assurer une observation dégagée de l’échantillon. De nombreux protocoles de nettoyage pour les diapositives de microscope ont déjà été documentés¹², mais ce n’est pas une étape qui est normalement rapportée dans les études expérimentales.

Enfin, les méthodes d’analyse des données sont le composant final de la spectroscopie à particules uniques. Les intensités maximales et minimales pour chaque nanoparticules doivent être mesurées, ainsi que la moyenne de fond locale. Les particules d’intérêt doivent être situées dans des zones sans débris de fond, défauts de substrat ou éclairage irrégulier. Une méthode pour déterminer le profil spectral d’une nanopartine consiste à calculer le contraste des particules à chaque longueur d’onde, en utilisant l’équation ci-dessous^11,13,14,15:

Alternativement, le spectre d’une seule particule peut être divisé en ses composantes de signal maximales et minimales individuelles, qui représentent les deux champs de polarisation de la DIC, affichant ainsi les deux spectres dépendant de directionnellement collectés simultanément, à travers les deux équations: