أداء الطيفي علي جسيمات نانويه Plasmonic مع القائم علي انتقال Nomarski نوع التداخل التفاضلي التباين المجهر
Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو التفصيل نهج ثبت لاعداد عينات جسيمات متناهي plasmonic ولأداء الطيفية الجسيمات واحد عليها مع تباين التداخل التفاضلي (DIC) المجهر.
Abstract
المجهر التفاضلي التباين (DIC) هو أداه التصوير القوية التي تستخدم الأكثر شيوعا لتصوير الأجسام المجهرية باستخدام ضوء المدى المرئي. والغرض من هذا البروتوكول هو التفصيل طريقه ثبت لاعداد عينات جسيمات متناهي plasmonic وأداء الطيفية الجسيمات واحد عليها مع المجهر DIC. ويجب اتباع العديد من الخطوات الهامه بعناية من أجل اجراء تجارب طيفيه قابله للتكرار. أولا ، يمكن حفر المعالم في الركيزة العينة ، والتي تساعد في تحديد مكان سطح العينة وفي تتبع المنطقة من الفائدة اثناء التجارب. بعد ذلك ، يجب تنظيف الركيزة بشكل صحيح من الحطام والملوثات التي يمكن ان تعيق أو تحجب فحص العينة. بمجرد ان يتم اعداد عينه بشكل صحيح ، يجب محاذاة المسار البصري لمجهر ، وذلك باستخدام كولر الاضاءه. مع معيار Nomarski نمط DIC المجهر ، قد يكون من الضروري دوران العينة ، لا سيما عندما الجسيمات النانويه plasmonic تظهر الخصائص البصرية التي تعتمد علي الاتجاه. لان المجهر DIC لديه اثنين من حقول الاستقطاب المتعامد المتاصله ، ونمط التباين DIC تعتمد علي الطول الموجي يكشف عن اتجاه جسيمات نانويه plasmonic علي شكل قضيب. وأخيرا ، يجب الاضطلاع بعناية بعمليات الحصول علي البيانات وتحليل البيانات. من الشائع ان تمثل بيانات الطيف الطيفي المستندة إلى DIC كقيمه تباين ، ولكن من الممكن أيضا تقديمها كبيانات كثافة. في هذه المظاهرة من DIC لطيفي الجسيمات واحد ، والتركيز علي جسيمات نانويه الذهب علي شكل كرويه وقضيب.
Introduction
ومنذ الثمانينات ، ينظر إلى المجهر التفاضلي المتباين للتداخل (DIC) إلى حد كبير علي انه طريقه تصوير مهمة محجوزه للأجسام المجهرية داخل العلوم البيولوجية. مهما, اثناء تطويره في الخمسينات والستينات, كان نويت هو كتقنية ل [متريلس] علم1. مع التطورات الاخيره في العلوم المادية المتعلقة بالجسيمات النانويه plasmonic ، وقد تم زيادة الاهتمام في توصيف المواد مع المجهر البصري مكان.
العديد من التقنيات البصرية هي بالتاكيد متاحه لتوصيف نانوماتيريال (علي سبيل المثال ، الحقل المظلم ، برايت فيلد ، الاستقطاب الضوء ، فلوري ، الخ). الحقل المظلم هو شعبيه علي نطاق واسع في البحوث الجسيمات متناهية ، ولكنه يعتمد فقط علي جمع مبعثر ويوفر معلومات محدوده حول العينات المعقدة2. الفلورية يمكن ان تكون مفيده ، ولكن فقط مع العينات التي الاناره أو التي يمكن ان تكون ملطخه بشكل صحيح. المجهر DIC لديه العديد من الصفات التي تجعل من أداه قيمه لتحليل الجسيمات النانويه. المزايا الأكثر شيوعا من DIC بالمقارنة مع غيرها من الطرق وفيما يتعلق بجسيمات نانويه plasmonic هي: لا تلطيخ عينه المطلوبة ، لا اثار هاله ، عمق الضحلة من الميدان ، وارتفاع القرار الجانبي3. DIC لديها نقاط القوه الاضافيه التي هي قيمه للبحوث جسيمات متناهي plasmonic. أولا وقبل كل شيء ، يوجد حقلان للاستقطاب المتاصل والمتعامد ، ويمكن قياسهما في وقت واحد لأغراض الطيفية2. ثانيا ، لا يتم التقاط اشاره الاستقطاب من الجسيمات النانويه في الصورة النهائية2، والتي يمكن ان تكون سببا للقلق الشديد في القياسات الطيفية الميدانية المظلمة.
الغرض من هذه المقالة هو توفير منهجيه واضحة لاستخدام المجهر الضوئي المرسلة الخفيفة لاجراء الطيفي علي جسيمات نانويه plasmonic. علي الرغم من ان DIC هو تقنيه قويه التي يمكن تطبيقها علي مواد متنوعة للغاية ، بل هو أيضا تقنيه تتطلب مهارة كبيره وفهم لتشغيله بشكل صحيح عند التصوير النانويه. المجهر المستندة إلى ناقل الحركة Nomarski DIC لديه مسار ضوء معقده1 التي سيتم فقط استعراضها بإيجاز هنا. يتم عرض القطار البصري من DIC في الشكل 1. وينتقل الضوء من خلال المجهر أولا يتم تمريرها من خلال المستقطب والمنظور تقسيم شعاع Nomarski قبل ان تركز علي المكثف علي الطائرة عينه. بعد المرور من خلال الهدف ، والضوء يصادف شعاع الجمع بين المنشور Nomarski ومحلل قبل الخروج إلى كاشف. المستقطبات اثنين والمناشير Nomarski هي حاسمه لتشكيل الصورة DIC وهي المسؤولة عن إنتاج المجالات الاستقطاب المتعامدين DIC1. للقارئ المهتمة في معرفه المزيد عن مبادئ العمل والمسار البصري من المجاهر DIC Nomarski ، أو الاختلافات بين Nomarski DIC وأنماط أخرى من DIC ، يرجى الرجوع إلى حسابات أخرى مكتوبه بشكل جيد علي هذه المواضيع1، 4 , 5 , 6 , 7–
من المهم بنفس القدر لفهم الطبيعة الاساسيه للجسيمات النانويه plasmonic قبل محاولة اجراء الطيفي عليها ، سواء كان ذلك مع Nomarski DIC ، حقل مظلم ، أو اي تقنيه المجهر الأخرى. في مجال plasmonics ، يتم تعريف جسيمات نانويه الجسيمات مع ابعاد علي مقياس 10-100 nm8،9. يمكن ان تاخذ الجسيمات النانويه علي العديد من الاشكال (علي سبيل المثال ، المجالات ، القضبان ، النجوم ، الاثقال ، الخ) ، ومعظم خصائصها الهامه تنشا من التفاعلات مع الضوء في نطاق الاشعه فوق البنفسجية المرئي-القريب من الطيف الكهرومغناطيسي. ولا يقتصر مصطلح “plasmonic” علي الجسيمات النانويه10؛ ومع ذلك ، عند مناقشه الجسيمات النانويه ، يتم استخدامه في الاشاره إلى الصدى الموضعي لسطح البلازما (LSPR خاص). [لسد] ظاهره في اي التوصيل الكترونات في [جسيمات متناهي] يتذبذب واجبه إلى [كولومبيك] تفاعل مع إشعاع كهرومغناطيسية من جدا محدده ونسبيا ضيقه تردد نطاق8. في هذه الترددات نفسها ، والجسيمات النانويه plasmonic تظهر زيادة امتصاص وتشتت الضوء ، مما يجعلها قابله للملاحظة مع المجهر البصري. في كثير من الحالات ، يفضل ان نلاحظ الجسيمات النانويه في حين وضع مرشحات الممرات قبل المكثف2، لتحسين التباين التصوير والقضاء علي الضوء الذي يفشل في الحث علي تاثير lspr. كما ان استخدام الفلاتر يجعل من الممكن اجراء تجارب طيفيه واحده للجسيمات.
السلوك البصري المرتبط بالشركة يعتمد إلى حد كبير علي حجم وشكل الجسيمات النانويه ، ويمكن التحقيق مع العديد من تقنيات المجهر البصري. ومع ذلك ، من أجل فك المعلومات التوجيهية من الجسيمات النانويه plasmonic مع التباين (اي غير كرويه) الشكل ، فمن الضروري استخدام الاستقطاب من حقل الضوء. بالتناوب بعناية حقل الاستقطاب أو الركيزة عينه بزيادات صغيره ، فمن الممكن لمراقبه الخصائص الطيفية التي تعتمد علي الاتجاه من الجسيمات النانويه الفردية. ويمكن ان يساعد الدوران والاستقطاب أيضا في تحديد ما إذا كانت السمة الطيفية ناجمه عن تذبذب النظام القطبي أو الأعلى للكترونات سطح الجسيمات متناهي. ومع ذلك ، ففي حاله الجسيمات النانويه الانسيابية (اي كرويه) ، يظل الملف الطيفي بدون تغيير أساسا عند تدوير العينة تحت ضوء مستقطب.
عند عرضها من خلال المجهر DIC (الشكل 2) ، والجسيمات النانويه لديها قرص مهواه مع مظهر الظل الزهر الأبيض والأسود ضد خلفيه رمادية. سوف الجسيمات النانويه كرويه الاحتفاظ بهذا المظهر تحت التناوب ومع تغيير مرشحات ممر. ومع ذلك ، فان الجزيئات تتلاشي تدريجيا من وجهه نظر كما يصبح الطول الموجي المركزي للمرشح أكثر فصلها من المجال الوحيد القطبية الطول الموجي LSPR11. ظهور nanorods يمكن ان تتغير بشكل كبير جدا لأنها استدارة2. Nanorods لديها اثنين من العصابات LSPR مع السلوك ثنائي القطبية ، والموقع الذي يستند إلى الابعاد المادية لل nanorods. عندما المحور الطولي لل nanorod هو المنحى موازيه لواحده من حقول الاستقطاب DIC ، فان القرص مهواه تظهر جميع الأبيض أو كل الأسود إذا كان ينظر اليها مع فلتر ممر المرتبطة بهذا الطول الموجي LNNNN. بعد تناوب عينه 90 درجه ، وسوف يستغرق علي اللون المعاكس. بدلا من ذلك ، نظرا لان المحور العرضي ل nanorod متعامد مع المحور الطولي ، فان القضيب سياخذ اللون المعاكس عند التبديل بين الفلاتر التي تتطابق مع الأطوال الموجية لجهاز الدوران للمحورين. في الاتجاات الأخرى وإعدادات التصفية ، سوف تظهر nanorods أكثر مثل المجالات ، وتقديم مجموعه متنوعة من أنماط القرص مهواه الظل المصبوب. ل nanorods مع محور عرضيه < 25 نانومتر ، فانه يمكن ان يكون من الصعب الكشف عن اشاره في هذا الطول الموجي LNN'S باستخدام المجهر DIC.
لاجراء الطيف الطيفي للجسيمات المفردة ، من المهم استخدام المكونات البصرية الصحيحة ومحاذاتها بشكل صحيح. يجب استخدام هدف قادر علي المجهر DIC. للتجارب الجسيمات واحد ، 80x أو 100x أهداف النفط مثاليه. Nomarski DIC المناشير عاده ما تاتي في ثلاثه أصناف: القياسية ، وارتفاع التباين ، وارتفاع القرار. النوع المثالي يعتمد بشكل كبير علي الغرض من التجربة وحجم الجسيمات النانويه. المناشير القياسية علي ما يرام بالنسبة للعديد من التجارب; ولكن عند العمل مع الجسيمات النانويه الصغيرة (< 50 نانومتر) ، يمكن ان تكون المنشورية عاليه التباين مفيده ، حيث ينخفض تباين الجسيمات مع انخفاض حجم الجزيئات11. يتم تحقيق ضبط التباين DIC اما عن طريق تدوير المستقطب أو عن طريق ترجمه واحده من الprisms DIC ، اعتمادا علي العلامة التجارية المجهر أو نموذج6.
بعد اعداد أضاءه كولر وإعدادات الاستقطاب ، من المهم عدم تعديل هذه الإعدادات اثناء جمع بيانات الطيف الطيفي. وعلاوة علي ذلك ، يجب الحفاظ علي متوسط ثابت لاشاره الخلفية في جميع الأوقات اثناء جمع البيانات ، حتى عند التبديل بين الفلاتر وإعدادات الزاوية. تعتمد قيمه الخلفية المثالية الفعلية علي النطاق الديناميكي للكاميرا العلمية ، ولكن بشكل عام ، يجب ان تكون الخلفية في نطاق 15% – 40% من مستوي الكشف الأقصى للكاميرا. وهذا يقلل من احتمال تشبع مستشعر الكاميرا مع تمكين التباين الأمثل للجسيمات. لجمع بيانات الطيف الطيفي ، من الضروري العمل مع كاميرا علميه تلتقط الصور بالأبيض والأسود ، بدلا من الكاميرا الملونة.
اعداد العينة هو جانب آخر حرجه من التصوير النانويه plasmonic. فمن المحتم ان مشغلي المجهر DIC لديهم فهم الخصائص البصرية للعينه والركيزة العينة. “قبل تنظيف” المجهر الزجاج ليست مستعدة بما فيه الكفاية للتصوير النانويه ، ويجب أعاده تنظيفها بشكل صحيح قبل ترسب عينه لضمان المراقبة دون عائق من العينة. تم توثيق العديد من بروتوكولات التنظيف لشرائح المجهر سابقا12، ولكنها ليست خطوه التي يتم الإبلاغ عنها عاده في الدراسات التجريبية.
وأخيرا ، فان أساليب تحليل البيانات هي المكون النهائي للتحليل الطيفي للجسيمات الواحدة. ويجب قياس الكثافة القصوى والدنيا لكل جسيمات متناهي ، فضلا عن متوسط الخلفية المحلية. يجب ان تكون الجزيئات ذات الاهميه موجودة في المناطق التي لا يوجد بها حطام خلفي أو عيوب في الركيزة أو أضاءه غير متساوية. طريقه واحده لتحديد الملامح الطيفية لجسيمات متناهي هو عن طريق حساب تباين الجسيمات في كل طول موجي ، وذلك باستخدام المعادلة أدناه11،13،14،15:
وبدلا من ذلك ، يمكن تقسيم طيف الجزيء الواحد إلى مكونات الاشاره القصوى والدنيا الفردية ، والتي تمثل مجالي الاستقطاب في DIC ، التالي عرض الأطياف التي تعتمد علي directionally والتي تم جمعها في نفس الوقت ، من خلال المعادلتين:
Protocol
Representative Results
Discussion
عند التصوير مع المجهر DIC ، فمن المهم لتحسين المكونات البصرية قبل جمع البيانات. حتى التعديلات الطفيفة علي المستقطب في منتصف التجربة يمكن ان تؤدي إلى تاثيرات كبيره علي البيانات النهائية6. وعلاوة علي ذلك ، تتطلب مواد مختلفه إعدادات الاستقطاب مختلفه. علي الرغم من انه تم استخدام اح…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الدكتور أنتوني س. ستندر يرغب في الاعتراف بالدعم الفني من خلال معهد الظواهر الكمية (NQPI) في جامعه أوهايو. وقد أتيحت هذه المادة من خلال بدء التمويل المقدم للدكتور ستندر من جامعه أوهايو.
Materials
| Contrad 70 | Decon Labs, Inc. | 1002 | For cleaning microscope glass, Available through many chemical suppliers |
| Ethanol | Fisher Scientific | A962-4 | For cleaning and storing microscope glass |
| Glass microscope cover slips | Ted Pella | 260148 | |
| Glass microscope slides | Ted Pella | 26007 | |
| Gold nanorods | Nanopartz | DIAM-SPR-25-650 | |
| Gold nanospheres (80 nm) | Sigma Aldrich | 742023-25ML | |
| ImageJ | NIH | N/A | Free Software availabe for data analysis from NIJ |
| Nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Nikon Ti-E microscope | Nikon | N/A | |
| Nitrogen gas | Airgas | N/A | |
| ORCA Flash 4.0 V2+ digital sCMOS camera | Hamamatsu | 77054098 | |
| Scribing pen | Amazon | N/A | Many options available online for under $10. Not necessary to buy an expensive version. |
| Ultrapure water | 18 megaohm |
References
- Pluta, M. Ch 7: Differential Interference Contrast in. Advanced Light Microscopy. 2, 146-197 (1989).
- Stender, A. S., Wang, G., Sun, W., Fang, N. Influence of Gold Nanorod Geometry on Optical Response. ACS Nano. 4 (12), 7667-7675 (2010).
- Stender, A. S., et al. Single Cell Optical Imaging and Spectroscopy. Chemical Reviews. 113 (4), 2469-2527 (2013).
- Mehta, S. B., Sheppard, C. J. R. Partially coherent image formation in differential interference contrast (DIC) microscope. Optics Express. 16 (24), 19462-19479 (2008).
- Murphy, D. B., Davidson, M. W. Ch 1: Fundamentals of Light Microscopy. Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging, Second edition. , 1-20 (2012).
- Stender, A. S., Augspurger, A. E., Wang, G., Fang, N. Influence of Polarization Setting on Gold Nanorod Signal at Nonplasmonic Wavelengths Under Differential Interference Contrast Microscopy. Analytical Chemistry. 84 (12), 5210-5215 (2012).
- Wang, G., Sun, W., Luo, Y., Fang, N. Resolving Rotational Motions of Nano-objects in Engineered Environments and Live Cells with Gold Nanorods and Differential Interference Contrast Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 132 (46), 16417-16422 (2010).
- Kelly, K. L., Coronado, E., Zhao, L. L., Schatz, G. C. The Optical Properties of Metal Nanoparticles: The Influence of Size, Shape, and Dielectric Environment. The Journal of Physical Chemistry B. 107 (3), 668-677 (2003).
- Mulvaney, P. Not All That’s Gold Does Glitter. MRS Bulletin. 26 (12), 1009-1014 (2012).
- Maier, S. A. . Plasmonics: Fundamentals and Applications. , (2007).
- Sun, W., Wang, G., Fang, N., Yeung, E. S. Wavelength-Dependent Differential Interference Contrast Microscopy: Selectively Imaging Nanoparticle Probes in Live Cells. Analytical Chemistry. 81 (22), 9203-9208 (2009).
- Cras, J. J., Rowe-Taitt, C. A., Nivens, D. A., Ligler, F. S. Comparison of chemical cleaning methods of glass in preparation for silanization. Biosensors and Bioelectronics. 14 (8), 683-688 (1999).
- Augspurger, A. E., Sun, X., Trewyn, B. G., Fang, N., Stender, A. S. Monitoring the Stimulated Uncapping Process of Gold-Capped Mesoporous Silica Nanoparticles. Analytical Chemistry. 90 (5), 3183-3188 (2018).
- Murphy, D. B., Davidson, M. W. Ch 2: Light and Color. Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging, Second Edition. , 21-33 (2012).
- Wayne, R. Ch 3: The Dependence of Image Formation on the Nature of Light. Light and Video Microscopy (Second Edition). , 43-78 (2014).
- Stender, A. S., Wei, X., Augspurger, A. E., Fang, N. Plasmonic Behavior of Single Gold Dumbbells and Simple Dumbbell Geometries. The Journal of Physical Chemistry C. 117 (31), 16195-16202 (2013).
- Hu, M., et al. Dark-field microscopy studies of single metal nanoparticles: understanding the factors that influence the linewidth of the localized surface plasmon resonance. Journal of Materials Chemistry. 18 (17), 1949-1960 (2008).
- Choo, P., et al. Wavelength-Dependent Differential Interference Contrast Inversion of Anisotropic Gold Nanoparticles. The Journal of Physical Chemistry C. 122 (47), 27024-27031 (2018).
- Funston, A. M., Novo, C., Davis, T. J., Mulvaney, P. Plasmon Coupling of Gold Nanorods at Short Distances and in Different Geometries. Nano Letters. 9 (4), 1651-1658 (2009).
