Здесь мы представляем протокол к культуре человека enteroid или colonoid монослои, которые имеют нетронутыми барьерную функцию для изучения принимающей эпителиальных микробиоты взаимодействия на уровне клеточных и биохимических.
Человека 3-мерные (3D) enteroid или colonoid культуры производный от крипты базовый стволовых клеток являются в настоящее время самые передовые модели ex vivo кишечного эпителия. Благодаря их закрытых структур и значительной поддержки внеклеточного матрикса 3D культуры не являются идеальными для исследования хост патогена. Enteroids или colonoids можно выращивать как эпителиального монослои на проницаемой ткани культуры мембраны позволяет управлять как Люминал и базолатеральной клеток поверхности, так и сопровождающих жидкости. Этот повышения Люминал поверхности доступность облегчает моделирования бактерий хост эпителиальных взаимодействиями, такими как способность унижающего достоинство слизь энтерогеморрагические E. coli (EHEC) на толстой эпителия. Описан метод для 3D культуры фрагментации, однослойная посева и измерения электрического сопротивления (тер) transepithelial для контроля за прогрессом на пути к confluency и дифференциации. Colonoid монослой дифференциации дает выделяется слизь, которая может быть изучен иммунофлюоресценции или immunoblotting методов. В целом enteroid или colonoid монослои позволяют физиологически соответствующие платформы для оценки конкретных клеточных популяций, которые могут быть объектом патогенных или синантропных микробиоты.
Кишечные organoids, enteroids и colonoids привели к многие достижения в понимании поведения стволовых клеток, кишечные развития, функции барьера/транспорта и клеточной дифференциации. 1 однако 3D культуры ограничивает исследования хост эпителия возбудитель взаимодействия потому что просвета не является напрямую доступной для бактерий или факторы вирулентности, если закрытые структуры подвергаются микроинъекции. 2 , 3 Кроме того, выделяется материалы, такие как малые молекулы, белки, или слизь нельзя легко брались 3D культуры для анализа ниже по течению. Воздействие патогенных агентов на эпителиальные барьер функция4 и ионного транспорта5 был оценен в 3D с использованием флуоресцентных красителей и time-lapse микроскопии культуре, но поддаются монослои, выращенных на проницаемой ткани культуры поддерживает Дополнительные методы, такие как измерение тер и Ussing палаты/напряжение зажим записи. 6 , 7
Многочисленные публикации описал протоколы для 2D или монослоя культуры enteroids/colonoids. Материалы, найденные для содействия эпителиальных клеток вложение включают коллаген гидрогели,8,9 0.1% желатина,10 тонкослойная мышиных саркома производные базальной мембраны матрица (BMM),,11,12 13 и человеческого коллагена IV. 6 , 7 , 14 , 15 , 16 , 17 посев подходы включают механические фрагментации, закупорить6,,1415 или диссоциации факторов адгезии клеток с помощью трипсина,10,11 dispase,13 или ЭДТА. 9 несколько протоколов использовать не пористых культуры ткани пластик для заполнения, но это ограничивает базолатеральной доступ, поэтому большинство приложений зависят от вставки проницаемых культуры ткани. Документация стабильной вырожденная монослоя формирования и поддержания варьируется среди публикаций. Кроме того рост и дифференцировку СМИ композиции для человеческих культур отличаются среди различных групп и продолжать развиваться как больше исследователей принять и скорректировать методологию с учетом их применения и имеющихся ресурсов.
Для устранения ограничений 3D кишечного эпителия культуры в хост возбудитель взаимодействия исследования, мы представляем измененного Протокола для преобразования 3D человеческого enteroids или colonoids в монослоя. После достижения confluency в состоянии склеп как незрелые, вывод факторов роста WNT3A, RSPO1 и ингибиторы A-83-01 и SB 202190 приводит к дифференциации представитель малого кишечных ворсинок или поверхности эпителия кишечника. Мы описываем идеальный матрица, человеческого коллагена типа IV, чтобы покрыть вставками и получить равномерное enteroid или colonoid фрагментов для покрытия. Мы показываем, что этот протокол производит вырожденная монослой с высоким Colonoid Тер монослои выделяют густой слизи апикальной слой, позволяя ex vivo исследований взаимодействия возбудителя слизи через immunoblotting или иммуноокрашивания. Изменение фиксации для сохранения кишечника слизи слой для иммуноокрашивания также описан. Этот метод призван обеспечить шансов справиться с возникающими модель для изучения ранних кишечных хост возбудитель взаимодействия после инфекции.
Критические параметры для успешного формирования enteroid/colonoid монослои включают 1) здоровым, размножающихся 3D культур как исходного материала; 2) покрытие поверхности вставить культуры клеток с человеческого коллагена IV до монослоя посева; 3) фрагментация 3D культур механически или энзиматического, но не на уровне отдельной ячейки.
Во время изоляции 3D enteroids/colonoids оптимальной пожимая скорость может варьироваться в зависимости от вращения диаметр данного шейкер модели. Целью является не только агитировать пластину для эффективного смешивания, но также избежать разбрызгивания суспензию клеток на крышке плита или в соседних скважин. Инкубационный период < 30 мин могут принести остаточного BMM цепляясь клетки, которые могут препятствовать привязанность и формирование единой клетки монослои когда покрытием на вставок. Обширные инкубации (≥ 1 h) даст жизнеспособность клеток значительно снизилась.
Степень Тритурация требуется отделить 3D enteroids/colonoids может варьироваться с поршневой жесткость и пользователя ловкость. Периодическое рассмотрение хорошо содержимого на световой микроскоп фазово контрастной рекомендуется для определения однородности фрагмент во время Тритурация, с целью приблизительно 30 ячеек на фрагмент. Вместо или в дополнение к Тритурация подвески можно кратко переваривается трипсином для получения меньшего единообразных фрагментов. Трипсин дайджест может быть желательным, если монослои содержат большое количество 3D-подобных структур среди противном случае однослойного эпителия. Однако диссоциации в отдельные ячейки не желательно, поскольку это значительно сокращает жизнеспособность клеток. Один хорошо культивированный в капельки BMM 35 мкл enteroids/colonoids будет достаточно, чтобы заполнить 2-3 вставки, но этот фактор может варьироваться в зависимости от числа и средний размер enteroids/colonoids.
Colonoid монослои может поглощать значительный объем апикальной среды как они дифференцируют. Это можно обойти путем применения дополнительных DM в верхней вставить камеру (150-200 мкл), хотя подсушки верхней палаты не представляется, отрицательно сказаться на жизнеспособности монослоя или функции в нижнем течении анализов. После примерно 4-5 дней дифференциации colonoid монослои развивать внеклеточной слизи, которая может быть видна как толстый/желатиновой материала на поверхности клеток после тщательного стремления дм.
Для инфекции ЭГКП взаимодействия с внешней слизь слой мы регулярно использовать бактериальных титр и инкубационного периода, указанного в протоколе. Однако уникальных штаммов бактерий первоначально быть assayed на несколько концентрации и инкубационных периодов определить соответствующие параметры для желаемого эффекта.
Во время фиксации слизи аспирационных апикальной среднего, скорее всего, удалить большую часть слоя внеклеточной слизи неприсоединенной. Таким образом важно тщательно слейте среды. Если среда сохраняется в Вставка поверхностное натяжение, используйте углу ткани сложить Лаборатория сломать поверхностное натяжение и фитиль от большинства среды. После фиксации и окраски слой слизи может непреднамеренно выбили или плоский во время монтажа coverglass над вставка фильтра. Чтобы сохранить высоту слизи, установите фильтр на падение монтажа СМИ и тщательно место coverglass на фильтре. Не коснитесь или нажмите вниз на coverglass, как это может значительно сгладить слой слизи.
Сформировать поляризованные монослоя от клеток в культуре 3D, это необходимо воспроизводить взаимодействие между базолатеральной интегринов мембраны клеток кишечного эпителия и белков внеклеточного матрикса (ECM). Ламинин, IV коллаген, фибронектин и массив протеогликаны составляют кишечного эпителия ECM. 21 , 22 мы сравнивали человеческих клеток, полученных Ламинин, фибронектин, коллаген IV и мышиным производные BMM как вставка покрытия. Коллаген IV поддерживается формирование стабильного, долгосрочного (до 4 недель) только вырожденная монослои enteroid/colonoid (рисунки 1-2). Небольшие участки монослоя как роста были получены на каждом из других протестированных матриц, но эти регионы не прогрессировали в confluency. Использование человеческого коллагена IV как суррогат ECM имеет ряд преимуществ. БММ производных от Engelbreth-холм-Рой (EHS), мышиных саркома клетки являются не человеческого происхождения, тогда как человеческий коллаген IV является коммерчески доступных и обычно более экономически эффективным. Кроме того BMM представляет собой сложную смесь белков с присущих изменчивости и могут содержать факторы роста, выделяемый саркома, которые влияют на экспрессию генов. 23
По-прежнему неполно понимается взаимодействие клеток кишечного эпителия и базовой ECM в кишечного эпителия реституции. Было предложено значение коллаген IV, но не Ламинин, как сцепления лигандом для человека colonocytes24 и усилитель кишечные крипты эпителиальных клеток реституции25 с использованием антител против коллаген IV, позволявшая вложений . Эпителиально выразил β1-Интегрин представляется важным для ECM взаимодействия, как антител специфических для β1-Интегрин значительно заблокирован адгезию colonocytes для типа IV коллагена. 24 а коллаген IV обеспечивает надежный ECM для enteroid/colonoid монослой формирования на вставок, эпителиальные Ремоделирование ECM со временем не еще была оценена в этой модели, ни влияние более сложных и определенных смесей ECM Коллаген IV, Ламинин и фибронектин.
Человеческого enteroids/colonoids в монослое формате (рисунки 1-4) включение манипуляции и выборки, будет громоздким или невозможно достичь с помощью 3D матрицы встроенный культур. 3D enteroids/colonoids различаются по размеру, структурной сложности и просветный тома, и таким образом трудно точно quantitate микроинъекции микробов или малых молекул. Кроме того в отличие от монослои (Таблица 1), 3D культур предотвратить прямой доступ к Люминал и базолатеральной поверхностей для измерения ионов, питательных веществ, цитокинов или выделяется факторы, связанные с физиологической или патофизиологические процессов . Confluency (рисунки 1-2) является одним из главных свойств enteroid/colonoid монослой, необходимых для создания не только физиологическое градиенты питательных веществ, ионов и других макромолекул,16 , но также создание надлежащего барьера между Люминал микробиоту и стерильные мезенхимальных/иммунной клетки заполняется серозных средах. Эти аспекты являются важными для будущих исследований, которые включают монослои enteroid/colonoid с типов мезенхимы, иммунитет или нейрональных клеток для построения более сложных физиологических моделей.
Отметил ограничения модели Вставка культуры клеток, описанной здесь включают в себя отсутствие физической силы, такие как жидкости касательное напряжение и механическое растяжение/сжатие (перистальтики), а анаэробных апикальной среды, обычно сталкиваются кишечника эпителия в естественных условиях. Эти элементы имеют потенциал, чтобы решать более сложные платформы microphysiological,26 , но они также требуют дополнительных затрат, оборудование и опыт для реализации. 3D и монослоя культуры являются также без взаимодействия с или взносов кишечная микрофлора, популяции стромальных клеток и иммунной системы, если целенаправленно добавлены эти компоненты.
Будущих приложений монослоя enteroid/colonoid на коллаген IV-покрытием клетки культуры вставок могут включать в себя другие исследования патогенных или синантропных микробной взаимодействия, наркотиков или питательных поглощения, токсичности, метаболизм, барьерные функции и функциональные повышение катализируемой Сопредседатель культуры с типами дополнительные клеток кишечника. Оценок могут быть сделаны не только в пределах эпителия здоровых доноров, но и от физических лиц с генетической мутации или кишечных расстройств, в естественных условиях фенотипов устанавливаются должны быть сохранены в ex vivo enteroid/colonoid культуры.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана NIH грантов P01 AI125181, K01 DK106323 (JGI) и K01 DK113043 (JFA). Мы благодарим Джеймса капер (Университет штата Мэриленд, Балтимор, MD, США) за предоставление E. coli штамм ЭГКП и HS. Мы также признаем комплексной физиологии и изображений ядра Хопкинс Конте пищеварительные болезни основных и переводческая исследовательский центр Core (P30 DK089502) и Джонса Хопкинса масс-спектрометрии и Proteomics ядро.
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol | Sigma | T4661 | Tris base, Component of lysis buffer |
A-83-01 | Tocris | 2939 | ALK4/5/7 inhibitor |
Acetic acid, glacial | Fisher Scientific | A38 | |
Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | Component of growth medium |
Alexa Fluor 488 phalloidin | Life Technologies | A12379 | Fluorescent probe for F-actin |
Antibiotic/antimycotic cocktail | Invivogen | ant-pm-2 | Primocin (100x) |
B27, 50x | Life Technologies | 17504-044 | Component of growth medium |
Cell culture inserts | Corning | 3470 | Transwell, PET membrane, 0.4 μm pore, 24-well plate |
CHIR 99021 | Tocris | 4423 | GSK3β inhibitor |
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Life Technologies | C10639 | |
Collagen IV, from human placenta | Sigma | C5533 | |
Cultrex Organoid Harvesting Solution | Trevigen | 3700-100-01 | Depolymerizes basement membrane matrix |
Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) | Kaper lab, University of Maryland | ||
Epithelial voltohmmeter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
Epithelial voltohmmeter electrode | World Precision Instruments | STX3 | |
Escherichia coli strain HS | Kaper lab, University of Maryland | ||
Ethanol, absolute | Pharmco | 111000200 | |
FluorSave mounting medium | Millipore | 345789 | For mounting insert membrane on microscope slide |
GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 200 mM |
HEK293T/Noggin-Fc cell line | van den Brink lab, Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research | For production of Noggin conditioned medium | |
HEK293T/RSPO1-Fc-HA cell line | Trevigen | 3710-001-K | For production of Rspondin-1 conditioned medium |
HEPES, 1 M | Life Technologies | 15630-080 | Component of growth medium |
Heraeus Multifuge X1R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004250 | |
Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Fluorescent nuclear dye |
Human epidermal growth factor (EGF) | R&D Systems | 236-EG-01M | Component of growth medium |
IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | Component of lysis buffer |
Inverted cell culture light microscope | Olympus | CKX51 | |
LB broth | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
L-WNT3A cell line | ATCC | CRL-2647 | For production of Wnt3a conditioned medium |
Matrigel, growth factor reduced | Corning | 356231 | Basement membrane matrix for 3D culture |
Mini cell scraper | United BioSystems | MCS-200 | |
MUC2 antibody, mouse monoclonal | Abcam | ab11197 | Use at 1:100 for immunostaining, 1:500 for immunoblotting |
MUC2 shRNA lentiviral particles | GE Dharmacon | RHS4531 | GIPZ lentiviral shRNA, ID: 4583 |
Orbital shaker | Grant Instruments | PSU-10i | |
Penicillin-streptomycin, 100x | Life Technologies | 15140-122 | Component of growth medium |
Phosphate buffered saline | Corning | 21-031 | |
Probe sonicator with microtip | Branson Ultrasonics | 450 | |
Protease inhibitor cocktail for mammalian cells | Sigma | P8340 | Component of lysis buffer |
SB 202190 | Tocris | 1264 | p38 MAPK inhibitor |
Sodium chloride | Sigma | S3014 | Component of lysis buffer |
Sodium dexoycholate | Sigma | D6750 | Component of lysis buffer |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma | L3771 | Component of lysis buffer |
TrypLE Express, 1x | Life Technologies | 12605-010 | Trypsin, for digesting enteroid/colonoid fragments |
Vinculin antibody, rabbit monoclonal | Abcam | ab129002 | Use at 1:1000 for immunoblotting |
Water, tissue culture grade, sterile filtered | Corning | 25-055 | |
Y-27632 | Tocris | 1254 | RhoA/ROCK inhibitor |