Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur menschlichen Kultur Enteroid oder Colonoid Monolagen, die intakten Barrierefunktion, Wirt epithelialen Mikrobiota Interaktionen auf die zelluläre und biochemische Ebene zu studieren.
Menschliche 3-dimensionale (3D) Enteroid oder Colonoid Kulturen Krypta Basis Stammzellen abgeleitet sind derzeit die am weitesten fortgeschrittene ex Vivo Modell des Darmepithels. Aufgrund ihrer geschlossenen Strukturen und deutliche unterstützende extrazelluläre Matrix sind 3D Kulturen nicht ideal für Wirt-Pathogen-Studien. Enteroids oder Colonoids als epitheliale Monolagen auf durchlässigen Gewebekultur Membranen ermöglichen Manipulation beider luminalen angebaut werden können und basolateralen Zelloberflächen und begleitenden Flüssigkeiten. Diese verbesserte luminalen Oberfläche Zugänglichkeit ermöglicht Modellierung bakterielle-Wirt epitheliale Interaktionen wie die Schleim-abbauenden Fähigkeit der Enterohemorrhagic E. Coli (EHEC) am Kolon Epithel. Eine Methode für 3D Culture Fragmentierung, Monolage Aussaat und Ttransepitelialen elektrischen Widerstand (TER) Messungen zur Überwachung des Fortschritts in Richtung Konfluenz und Differenzierung werden beschrieben. Colonoid Monolage Differenzierung ergibt sezernierten Schleim, der durch die Immunfluoreszenz oder Immunoblotting Techniken studiert werden kann. Enteroid oder Colonoid Monolagen ermöglichen ganz allgemein eine physiologisch relevanten Plattform, spezifische Zellpopulationen zu bewerten, die durch Pathogene oder Kommensalen Mikrobiota ausgerichtet werden kann.
Intestinale Organellen, Enteroids und Colonoids führten zu viele Fortschritte in der Stammzell-Verhalten, Darm Entwicklung, Barriere/Transportfunktion und zellulare Unterscheidung zu verstehen. 1 beschränkt jedoch 3D Culture das Studium der epithelialen-Erreger-Interaktion Hosts weil das Lumen nicht direkt erreichbar, Bakterien ist oder Virulenz Faktoren, es sei denn, die geschlossenen Strukturen Mikroinjektion ausgesetzt sind. 2 , 3 zusätzlich Materialien wie kleine Moleküle, Proteine, abgesondert oder Schleim kann nicht leicht von 3D Culture für die nachgelagerte Analyse abgetastet werden. Die Auswirkungen von Krankheitserregern auf epitheliale Barriere-Funktion4 und Ionen-Transport5 wurde in 3D Culture mit Fluoreszenzfarbstoffen und Zeitraffer Mikroskopie bewertet, aber Monolagen auf durchlässigen Gewebekultur unterstützt angebaut sind zugänglich zusätzliche Techniken wie TER Mess- und h Kammer/Spannung Klemme Aufnahme. 6 , 7
Zahlreiche Publikationen haben Protokolle für 2D- oder Monolayer Kultur des Enteroids/Colonoids beschrieben. Förderung der Epithelzelle Anlage gefunden Materialien enthalten Kollagen Hydrogele,8,9 0,1 % Gelatine,10 murinen Sarkom abgeleitet Basalmembran Dünnschicht-Matrix (BMM),11,12, 13 und menschlichen Kollagen IV. 6 , 7 , 14 , 15 , 16 , 17 Aussaat Ansätze umfassen mechanische Fragmentierung durch pipettieren,6,14,15 und/oder Dissoziation der Zelle Adhäsion Faktoren mit Trypsin,10,11 Dispase,13 oder EDTA. 9 ein paar Protokolle verwenden porenfrei Gewebekultur Kunststoffprodukte für die Aussaat, aber dies schränkt den basolateralen Zugriff, so dass die meisten Anwendungen abhängig von durchlässigen Gewebekultur Einsätze. Dokumentation der stabilen konfluierende Monolage Bildung und Pflege sehr unterschiedlich zu den Publikationen. Darüber hinaus Wachstum und Differenzierung Medien Kompositionen für menschliche Kulturen unterscheiden sich zwischen verschiedenen Gruppen und weiter zu entwickeln, da mehr Forscher übernehmen und anpassen die Methodik ihrer Anwendung und verfügbaren Ressourcen angepasst.
Um die Einschränkungen von 3D intestinalen epithelialen Culture in Wirt-Pathogen Interaktionen Studien zu beheben, stellen wir einen geänderten Protokoll zum Konvertieren von 3D menschliche Enteroids oder Colonoids in einem monomolekularen Film. Nach dem Erreichen der Konfluenz in einer Krypta-artigen unreifen Zustand, führt Entzug von Wachstumsfaktoren WNT3A, RSPO1 und Inhibitoren A-83-01 und SB-202190 zu Differenzierung Vertreter der kleinen Darm Villus oder Kolon Oberflächenepithel. Wir beschreiben die ideale Matrix, menschliche Kollagen Typ IV, um die Einsätze zu beschichten und einheitliche Enteroid oder Colonoid Fragmente für Beschichtung erhalten. Wir zeigen, dass dieses Protokoll eine konfluierende Monolage mit hohem produziert ter Colonoid Monolagen einer dicken apikalen Schleimschicht absondern Ex Vivo -Studien der Erreger-Schleim Interaktion via Immunoblotting oder Immunostaining ermöglicht. Ein veränderter Fixierung Verfahren der Kolon Schleimschicht für Immunostaining zu bewahren wird ebenfalls beschrieben. Diese Methode soll ein gefügig Modell, um die frühesten Darm Wirt-Pathogen Interaktionen bei der Infektion zu studieren.
Wichtige Parameter für erfolgreiche Bildung von Enteroid/Colonoid Monolagen beinhalten 1) gesund, wuchernden 3D Kulturen als Ausgangsmaterial; (2) Beschichtung der Zelloberfläche mit menschlichen Kollagen IV vor der Aussaat Monolayer Kultur einfügen; (3) die Fragmentierung von 3D Kulturen mechanisch oder enzymatisch, aber nicht auf die einzelne Zelle-Niveau.
Während der Isolation der 3D Enteroids/Colonoids variiert die optimale Schütteldrehzahl je nach Drehzahl Durchmesser eines bestimmten Shaker-Modells. Die Absicht ist nicht nur die Platte für eine effektive Mischung, aber auch zu vermeiden, spritzt der Zellsuspension auf dem Cover der Platte oder in benachbarten Vertiefungen agitieren. Inkubationszeiten von < 30 min können Ausbeute residual BMM klammerte sich an Zellen, die Anlage und die Bildung von einheitlichen Zelle Monoschichten wenn auf Einsätze verchromt behindern können. Umfangreiche Inkubation (≥ 1 h) erbringt deutlich verminderte Zellviabilität.
Das Ausmaß der Verreibung benötigt, um 3D Enteroids/Colonoids distanzieren kann mit Kolben Steifigkeit und Benutzer Geschicklichkeit variieren. Regelmäßige Überprüfung der gut Inhalte auf einem Phasenkontrast-Lichtmikroskop wird empfohlen, Fragment Gleichförmigkeit während Verreibung, mit einem Ziel von etwa 30 Zellen pro Fragment zu bestimmen. Anstelle oder neben Verreibung kann die Aussetzung mit Trypsin, kleinere einheitliche Fragmente zu erhalten kurz verdaut werden. Trypsin verdauen kann wünschenswert sein, wenn Monolagen einen Großteil der 3D-artige Strukturen unter eine ansonsten einzelne Epithelschicht enthalten. Dissoziation, einzelne Zellen ist jedoch nicht wünschenswert, da dies wesentlich Zellviabilität abnimmt. Einen Brunnen von Enteroids/Colonoids in einem 35 μL BMM Tröpfchen kultiviert wird in der Regel ausreichen, um 2-3 Einsätze zu füllen, aber dieser Faktor variiert je nach Anzahl und durchschnittliche Größe der Enteroids/Colonoids.
Colonoid Monolagen können ein beträchtliches Volumen des Mediums apikalen absorbieren, wie sie zu unterscheiden. Dies kann umgangen werden, indem zusätzliche DM auf der oberen einfügen-Kammer (150-200 μL), obwohl teilweise Austrocknen der oberen Kammer nicht erscheint, Monolage Lebensfähigkeit oder Funktion in nachgeschalteten Tests negativ. Nach ca. 4-5 Tagen der Differenzierung entwickeln Colonoid Monolagen extrazellulärem Schleim, der nach dem vorsichtig Absaugen von DM als dick/gallertartigen Material auf der Zelloberfläche sichtbar sein kann.
Für die EHEC-Interaktion mit der äußeren Schleimschicht verwenden wir routinemäßig die bakterielle Titer und Inkubation Frist im Protokoll. Einzigartige Bakterienstämme sollten jedoch zunächst in mehreren Konzentrationen und Inkubationszeiten zu bestimmen, die entsprechenden Parameter für die gewünschte Wirkung untersucht werden.
Während Schleim Fixierung wird Absaugen der apikalen Mediums wahrscheinlich die meisten der extrazellulären ungebunden Schleimschicht entfernen. Daher ist es wichtig, sorgfältig das Medium ausgießen. Wenn das Medium im Einsatz durch Oberflächenspannung beibehalten wird, verwenden Sie die Ecke eines gefalteten Labor Gewebes um die Oberflächenspannung zu brechen und Docht entfernt die meisten des Mediums. Nach Fixierung und Färbung kann die Schleimschicht unbeabsichtigt verdrängt oder abgeflacht bei der Montage ein Deckglas über dem Filter einfügen. Um Schleim-Höhe zu erhalten, setzen Sie den Filter auf einen Rückgang der Montage Medien und legen Sie sorgfältig das Deckglas auf den Filter. Nicht tippen Sie oder drücken Sie auf das Deckglas, wie dies die Schleimschicht deutlich reduzieren kann.
Um eine polarisierte Monolage von Zellen in 3D Culture zu bilden, ist es notwendig, das Zusammenspiel der basolateralen Membran Integrine des intestinalen epithelialen Zellen und Proteine der extrazellulären Matrix (ECM) zu reproduzieren. Laminin, Kollagen IV, Fibronektin und ein Array von Proteoglykanen dar der intestinale epitheliale ECM. 21 , 22 wir gegenüber menschlichen Zelle abgeleitet Laminin, Kollagen IV, Fibronektin und Murine abgeleitet BMM als Insert-Beschichtungen. Nur Kollagen IV die Bildung von stabilen und langfristig (bis zu 4 Wochen unterstützt) konfluierende Enteroid/Colonoid Monoschichten (Abbildungen 1-2). Kleine Flecken von Monolayer-Wachstum wurden auf jedem der anderen getesteten Matrizen erhalten, aber diese Regionen konnten sich zur Konfluenz Fortschritt. Einsatz von menschlichen Kollagen IV wie die ECM-Leihmutter eine Reihe von Vorteilen hat. BMM abgeleitet von Engelbreth-Holm-Schwarm (EHS) murinen Sarkom Zellen nicht menschlichen Ursprungs sind, während menschliche Kollagen IV im Handel erhältlich und in der Regel kostengünstiger ist. Darüber hinaus das BMM ist ein komplexes Gemisch von Proteinen mit inhärenten Variabilität und enthalten das Sarkom sezerniert Wachstumsfaktoren, die Genexpression beeinflussen. 23
Wechselwirkungen zwischen intestinalen Epithelzellen und die zugrunde liegenden ECM in intestinalen epithelialen Restitution ist noch nicht vollständig verstanden. Die Bedeutung von Kollagen IV, aber nicht Laminin, als eine Adhäsion Liganden für menschliche Colonocytes24 und Enhancer Darm Krypta Epithelzelle Rückgabe25 ist vorgeschlagen worden, mit Antikörpern gegen Kollagen IV, die Anlage verhindert . Epitheliale ausgedrückt β1-Integrin scheint für ECM Interaktion wichtig sein, wie ein Antikörper, der spezifisch für β1-Integrin deutlich Haftung des Colonocytes Typ IV Kollagen blockiert. 24 während Kollagen IV eine zuverlässige ECM bietet für Enteroid/Colonoid Monolage Bildung auf Einsätze, epithelialen Umgestaltung des ECM im Laufe der Zeit wurde nicht noch bewertet in diesem Modell, noch hat Sie den Einfluss von komplexer und definierten ECM-Mischungen aus Kollagen IV, Laminin und Fibronektin.
Menschliche Enteroids/Colonoids in monomolekularen Film Format (Abbildungen 1-4) ermöglichen Manipulationen und Probenahme, die umständlich oder unmöglich zu erreichen, mit 3D Matrix eingebettet Kulturen wäre. 3D Enteroids/Colonoids variieren in Größe, strukturelle Komplexität und luminalen Volumen und Mikroinjektion von Mikroben oder kleine Moleküle sind daher schwerlich genau quantitate. Darüber hinaus verhindern, dass im Gegensatz zu der Monolayer (Tabelle 1), 3D Kulturen Direktzugriff auf der luminalen und basolateralen Oberflächen, Ionen, Nährstoffe, Cytokinen oder sezernierten Faktoren im Zusammenhang mit physiologischen oder pathophysiologische Prozesse zu messen . Konfluenz (Abbildungen 1-2) ist eine der wichtigsten Eigenschaften der Enteroid/Colonoid Monolage für Gründung nicht nur die physiologischen Verläufe von Nährstoffen, Ionen, und andere Makromoleküle,16 , sondern auch die Schaffung der richtigen Barriere notwendig zwischen luminalen Mikrobiota und sterilen mesenchymalen/Immune Zellen besiedelt serosal Umgebungen. Diese Facetten sind wichtig für zukünftige Studien zu betrachten, die Enteroid/Colonoid Monolagen mit mesenchymalen, immun oder neuronalen Zelltypen Erstellung komplexer physiologische Modelle integrieren.
Bekannte Grenzen des hier beschriebenen Zelle Kultur einfügen Modells gehören mangelnde körperliche Kräfte wie flüssige Schubspannung und mechanische Dehnung/Kompression (Peristaltik) und kein anaeroben apikalen Umfeld normalerweise durch intestinale erlebt Epithelien in-vivo. Diese Elemente haben das Potenzial, mit raffinierter Microphysiological Plattformen,26 angesprochen werden, aber sie erfordern auch zusätzliche Kosten, Ausrüstung und Know-how zur Umsetzung. 3D und Monolayer-Kulturen sind auch ohne Interaktionen mit oder Beiträge aus den Darm Mikrobiom, stromale Zellpopulationen und das Immunsystem, es sei denn, diese Komponenten gezielt hinzugefügt werden.
Zukünftige Anwendungen der Enteroid/Colonoid Monolage auf Kollagen IV-beschichtete Zelle Kultur Einsätze umfassen andere Studien von pathogenen oder Kommensalen mikrobielle Wechselwirkungen, Barrierefunktion, Drogen- oder Nährstoff-Aufnahme, Toxizität, Stoffwechsel und funktional Verbesserung durch Kokultur mit zusätzlichen Darm Zelltypen katalysiert. Auswertungen können nicht nur in Epithelien von gesunden Spendern, sondern auch von Personen mit Genmutationen oder Darm-Erkrankungen, vorgenommen werden, sofern die in-vivo Phänotypen niedergelassen sind, in ex-Vivo Enteroid/Colonoid Kultur bewahrt werden.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von NIH-Stipendien P01 AI125181, K01 DK106323 (JGI) und K01 DK113043 (JFA) unterstützt. Wir danken James Kaper (University of Maryland, Baltimore, MD, USA) für die Bereitstellung von E. Coli Stamm HS und EHEC. Wir erkennen auch die integrierte Physiologie und Bildgebung Kerne von der Hopkins Conte verdauungsfördernde Krankheit Basic und translationale Forschung Core Center (P30 DK089502) und der Johns Hopkins Mass Spectrometry und Proteomics Core.
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol | Sigma | T4661 | Tris base, Component of lysis buffer |
A-83-01 | Tocris | 2939 | ALK4/5/7 inhibitor |
Acetic acid, glacial | Fisher Scientific | A38 | |
Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | Component of growth medium |
Alexa Fluor 488 phalloidin | Life Technologies | A12379 | Fluorescent probe for F-actin |
Antibiotic/antimycotic cocktail | Invivogen | ant-pm-2 | Primocin (100x) |
B27, 50x | Life Technologies | 17504-044 | Component of growth medium |
Cell culture inserts | Corning | 3470 | Transwell, PET membrane, 0.4 μm pore, 24-well plate |
CHIR 99021 | Tocris | 4423 | GSK3β inhibitor |
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Life Technologies | C10639 | |
Collagen IV, from human placenta | Sigma | C5533 | |
Cultrex Organoid Harvesting Solution | Trevigen | 3700-100-01 | Depolymerizes basement membrane matrix |
Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) | Kaper lab, University of Maryland | ||
Epithelial voltohmmeter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
Epithelial voltohmmeter electrode | World Precision Instruments | STX3 | |
Escherichia coli strain HS | Kaper lab, University of Maryland | ||
Ethanol, absolute | Pharmco | 111000200 | |
FluorSave mounting medium | Millipore | 345789 | For mounting insert membrane on microscope slide |
GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 200 mM |
HEK293T/Noggin-Fc cell line | van den Brink lab, Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research | For production of Noggin conditioned medium | |
HEK293T/RSPO1-Fc-HA cell line | Trevigen | 3710-001-K | For production of Rspondin-1 conditioned medium |
HEPES, 1 M | Life Technologies | 15630-080 | Component of growth medium |
Heraeus Multifuge X1R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004250 | |
Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Fluorescent nuclear dye |
Human epidermal growth factor (EGF) | R&D Systems | 236-EG-01M | Component of growth medium |
IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | Component of lysis buffer |
Inverted cell culture light microscope | Olympus | CKX51 | |
LB broth | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
L-WNT3A cell line | ATCC | CRL-2647 | For production of Wnt3a conditioned medium |
Matrigel, growth factor reduced | Corning | 356231 | Basement membrane matrix for 3D culture |
Mini cell scraper | United BioSystems | MCS-200 | |
MUC2 antibody, mouse monoclonal | Abcam | ab11197 | Use at 1:100 for immunostaining, 1:500 for immunoblotting |
MUC2 shRNA lentiviral particles | GE Dharmacon | RHS4531 | GIPZ lentiviral shRNA, ID: 4583 |
Orbital shaker | Grant Instruments | PSU-10i | |
Penicillin-streptomycin, 100x | Life Technologies | 15140-122 | Component of growth medium |
Phosphate buffered saline | Corning | 21-031 | |
Probe sonicator with microtip | Branson Ultrasonics | 450 | |
Protease inhibitor cocktail for mammalian cells | Sigma | P8340 | Component of lysis buffer |
SB 202190 | Tocris | 1264 | p38 MAPK inhibitor |
Sodium chloride | Sigma | S3014 | Component of lysis buffer |
Sodium dexoycholate | Sigma | D6750 | Component of lysis buffer |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma | L3771 | Component of lysis buffer |
TrypLE Express, 1x | Life Technologies | 12605-010 | Trypsin, for digesting enteroid/colonoid fragments |
Vinculin antibody, rabbit monoclonal | Abcam | ab129002 | Use at 1:1000 for immunoblotting |
Water, tissue culture grade, sterile filtered | Corning | 25-055 | |
Y-27632 | Tocris | 1254 | RhoA/ROCK inhibitor |