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Immunology and Infection

Monocouches de Colonoid humain pour étudier les Interactions entre les pathogènes, germes commensaux et hôte épithélium Intestinal

Published: April 09, 2019
doi:
10.3791/59357
, , ,
1Department of Internal Medicine,University of New Mexico Health Science Center, 2Department of Medicine, Division of Gastroenterology & Hepatology,Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Nous présentons ici un protocole se rapportant à la culture humaine enteroid ou monocouches de colonoid qui ont la fonction de barrière intact pour étudier les interactions épithéliales-microbiote hôte aux niveaux cellulaire et biochimique.

Abstract

3 dimensions (3D) enteroid ou colonoid les cultures humaines dérivées de cellules souches base de crypte sont actuellement le modèle plus avancé ex vivo de l’épithélium intestinal. En raison de leurs structures fermées et prise en charge de la matrice extracellulaire importante, cultures 3D ne sont pas idéales pour les études de l’hôte-pathogène. Enteroids ou colonoids peut être cultivé comme monocouches épithéliales sur des membranes de culture de tissu perméable pour permettre la manipulation des deux Luminale et surfaces cellulaires basolatérale et fluides qui l’accompagne. Cette accessibilité accrue de surface Luminale facilite la modélisation des interactions épithéliales bactérie-hôte telles que la capacité de dégrader de mucus d’entérohémorragique Escherichia coli (EHEC) sur l’épithélium colique. Une méthode pour la fragmentation de la culture 3D, monocouche ensemencement et transépithélial des mesures de résistance électrique (TER) pour surveiller la progression vers la confluence et la différenciation sont décrites. Différenciation de monocouche Colonoid rendements mucus sécrété qui peuvent être étudiés par les techniques d’immunofluorescence ou immunoblotting. Plus généralement, monocouches enteroid ou colonoid permettent une plate-forme physiologiquement pertinents évaluer les populations de cellules spécifiques peuvent être ciblées par des micro-organismes pathogènes ou commensales.

Introduction

Colonoids, enteroids et organoïdes intestinale ont conduit à nombreuses avancées dans la compréhension du comportement de cellules souches, développement intestinal, fonction de barrière/transport et différenciation cellulaire. 1 culture 3D limite toutefois l’étude de l’interaction hôte épithéliales-pathogène car la lumière n’est pas directement accessible aux bactéries ou de facteurs de virulence, à moins que les structures fermées sont soumis à la microinjection. 2 , 3 en outre, sécrétée des matériaux tels que de petites molécules, les protéines, ou mucus ne peut pas être facilement prélevé culture 3D pour l’analyse en aval. L’impact des agents pathogènes sur la barrière épithéliale fonction4 et ion transport5 a été évaluée dans la culture 3D à l’aide de colorants fluorescents et microscopie time-lapse, mais monocouches cultivées sur des supports de culture de tissus perméables peuvent faire l’objet techniques complémentaires telles que TER mesure et enregistrement de Ussing chambre/voltage clamp. 6 , 7

Nombreuses publications ont décrit les protocoles de culture 2D ou monocouche d’enteroids/colonoids. Les matériaux trouvés pour promouvoir la fixation des cellules épithéliales comprennent hydrogels de collagène, gélatine de 0,1 %8,9 ,10 murine couche mince membrane de sous-sol dérivé de sarcome matrix (BMM),11,12, 13 et collagène humain IV. 6 , 7 , 14 , 15 , 16 , 17 ensemencement des approches incluent la fragmentation mécanique en pipettant également,6,14,15 ou dissociation des facteurs d’adhésion cellulaire à l’aide de la trypsine,10,11 a,13 ou EDTA. 9 quelques protocoles utilisent ustensiles en plastique non poreux tissue culture par semis, mais cela limite l’accès basolatérale, donc la plupart des applications dépendant des inserts de culture de tissu perméable. Documentation de formation de monocouches confluentes stable et d’entretien varie considérablement entre les publications. En outre, la croissance et la différenciation des compositions de médias pour les cultures humaines diffèrent entre les divers groupes et continuent d’évoluer à mesure que davantage de chercheurs adopte et adapter la méthodologie en fonction de leur application et les ressources disponibles.

Pour pallier les lacunes de la 3D culture épithéliale intestinale dans les études sur les interactions hôte-pathogène, nous présentons un protocole modifié pour conversion en 3D enteroids humaine ou colonoids une monocouche. Après la réalisation de confluence à l’état immature ressemblant à des cryptes, retrait des facteurs de croissance WNT3A, RSPO1 et inhibiteurs de la A-83-01 et SB 202190 mène à différenciation représentante des petites villosités intestinales ou épithélium colique superficiel. Nous décrivons la matrice idéale, collagène humain de type IV, pour enrober les inserts et obtenir des fragments d’enteroid ou colonoid uniformes pour l’électrodéposition. Nous démontrons que ce protocole produit une monocouche confluente avec une haute Colonoid ter monocouches sécrètent une couche de mucus épais d’apicale, permettant des études ex vivo de l’interaction pathogène-glaire par immunotransfert ou immunostaining. Une procédure de fixation modifiés afin de préserver la couche de la muqueuse colique pour immunostaining est également décrite. Cette méthode vise à fournir un modèle tractable pour étudier les interactions hôte-pathogène intestinal plus tôt après l’infection.

Protocol

Ce protocole est basé sur des études déjà publiées par les auteurs. 6 , 7 , 14 , 15 , 16 les étapes suivantes doivent être effectuées dans une armoire de biosécurité stérile à l’aide de techniques aseptiques appropriées. Toutes les méthodes impliquant des spécimens humains ont été approuvés par les institutionnels Review Board de Johns Hopkins University School of Medicine (IRB NA_00038329). 1. enduire les inserts de culture cellulaire avec la matrice extracellulaire Préparer 5 mL de solution stock collagène IV (1 mg/mL) dans l’acide acétique 100 mM. Laisser reposer à 4 ° C pendant environ 4 h d’entièrement hydrate/dissolution. Aliquoter le collagène IV solution mère et stocker à 4 ° C (≤ 1 mois) ou à-20 ° C (> 1 mois). Immédiatement avant le revêtement, diluer la solution mère de collagène IV en eau de qualité de vitroplants stérile à une concentration finale de 34 µg/mL. Plaque 24 puits culture cellulaire s’insère, manteau chacun insérer avec 100 μL de solution, ce qui correspond à 10 μg/cm2. Incuber la plaque dans un standard CO2 vitroplants incubateur à 37 ° C pendant ≥ 2 h, ou par souci de commodité, sceller les bords de la plaque avec le film de paraffine et incuber à 4 ° C durant la nuit ou jusqu’à 1 semaine. 2. isoler enteroids/colonoids de culture 3D Remarque : Enteroids ou colonoids sont établies à partir des biopsies de donateur et maintenues en culture 3D conformément aux protocoles standards décrit précédemment. 14 , 18 brièvement, les cryptes sont récoltées de biopsies intestinales ou résections via chélation et agitation mécanique. Les cryptes sont lavés, récoltés et plaqués en BMM. Support d’expansion (décrit à l’étape 4.2) est ajoutée à la culture et remplacé tous les 2 jours. Formation de culture 3D est visible quelques heures après l’ensemencement. Aspirer le milieu de culture de la plaque 24 puits et remplacer par 1 mL de solution récolte glacée (voir Tableau des matériaux) / puits. Utilisez un grattoir de cellules mini pour déloger et éclatement le culot de matrice de membrane basale, une attention particulière à toute matière près des bords bien. Agiter la plaque dans un agitateur orbital à environ 200 tr/min, 4 ° C pendant 30-45 min. 3. se dissocient 3D enteroids/colonoids Utiliser une pipette de monocanal P200 ou une pipette multi-canaux équipés d’embouts de filtration stériles à triturer la suspension cellulaire. La piscine le suspension(s) de cellule dans une fiole conique de 15 mL. Utiliser plusieurs flacons si le volume total de suspension est > 6 mL. Ajouter un volume égal de milieu DMEM/F12 Advanced contenant 10 mM HEPES, dipeptide L-alanyl-L-glutamine (1 x) et la pénicilline-streptomycine (1 x) (milieu de lavage). Inverser le tube 3 – 4 fois pour mélanger. Centrifuger à 300 x g, 10 min, 4 ° C. Éventuellement, aspirer le milieu de lavage et remplacer par 0,5 mL/puits trypsine (voir Table des matières). Resuspendre colonoids avec une pipette de P200, boucher le tube et placer dans un bain-marie à 37 ° C pour environ 2 min. immédiatement retirer le tube, lavage moyen s’ajoute un volume final de 10 mL et répétez la centrifugation comme étape 3.3.Remarque : Cette étape peut être préférable si trituration n’entraîne pas des fragments de tailles uniforme. 4. la suspension d’enteroid/colonoid de placage Si plaquettes revêtues étaient stockés à 4 ° C, laisser s’équilibrer dans une étuve de vitroplants de2 °C/5% CO 37 pendant au moins 30 min avant la culture cellulaire. Pour chaque insertion d’être plaqué, prépare 1 mL de milieu de chaud (entre 25 et 37 ° C) extension (EM) et ajoute 10 μM de Y-27632 et 10 μM de CHIR 99021.NOTE : EM est composé de Advanced DMEM/F12 contenant B27 (1 x), 50 % WNT3A conditionnés moyen, 15 % RSPO1 conditionné médium, 10 % Noggin conditionnée moyen, EGF humaine de 50 ng/mL, 500 nM A-83-01, 10 μM SB 202190, antibiotique/antimycosiques cocktail (1 x), 10 mM HEPES, L-alanyl-L-glutamine dipeptide (1 x) et la pénicilline-streptomycine (1 x) (voir la Table des matières). Aspirer le milieu de lavage du tube contenant le culot cellulaire et remettre en suspension dans un volume de EM suffisante pour donner au moins 100 μL/insert. Aspirer la solution IV de collagène de chaque insertion et laver deux fois avec 150 μl de milieu lavage par plaquette. Pipeter 600 μL d’EM dans l’espace sous chaque insertion. Ajouter 100 μl de la suspension de cellules dans chaque insertion. Remettez la plaque dans l’incubateur de culture de tissus et laisser reposer pendant au moins 12 h.Remarque : Évitez les secouant ou en inclinant fortement la plaque afin d’éviter une répartition inégale des fragments colonoid sur la membrane de l’insert. Contrôler la fixation des cellules et la diffusion pour former une monocouche confluente en plaçant la plaque sur un microscope optique à contraste de phase sous un 2.5 x-10 x objectif. Après 1 à 2 jours, la plupart des fragments devraient adhérer à la matrice de collagène. Actualiser le milieu de culture et d’interrompre le traitement avec Y-27632 et CHIR 99021. Continuer à actualiser le support tous les 2-3 jours jusqu’au confluent. Confluence est généralement atteint en 7-10 jours. 5. mesurer la résistance électrique transépithéliale Attacher les fils des électrodes et la puissance sur le voltohmmeter épithélial (EVOM). Vérifiez que la fonction de mesure est définie sur Ohm. Trempez les extrémités des électrodes brièvement dans l’éthanol à 70 % et essuyez avec un tissu de laboratoire. Equilibrer l’électrode dans 5 mL de milieu de lavage pendant environ 5 min. Plonger l’électrode plus court dans le milieu de l’insert et orienter la pointe de l’électrode plus longtemps dans la plaque bien inférieure. Maintenir l’électrode dans une orientation verticale complète jusqu’à ce que la lecture EVOM est relativement stable, ou pour pas plus de 60 s.NOTE : Si l’électrode est incliné loin verticale ou la hauteur de la pointe est mal réglée, l’extrémité plus courte peut entrer en contact avec et perturber la monocouche de cellules. Comparer les mesures EVOM la valeur obtenue par un insert acellulaire immergé dans le milieu de culture pour évaluer les progrès vers la confluence ou différenciation. 6. différenciation des monocouches confluentes d’enteroid/colonoid Échanger les EM pour moyen de différenciation (DM) et continuer à actualiser les médias tous les deux jours jusqu’au jour 5. DM est EM qui n’a pas de WNT3A, RSPO1, A-83-01 et SB 202190. Continuer à surveiller les TER afin de vérifier que la différenciation se déroule comme prévu. TER continuera d’augmenter au cours des jours 1-5 de la différenciation. Monocouches peuvent continuer à augmenter TER et viables au-delà de jour 5-6, mais présentent des résultats maximum et plus reproductibles lorsqu’il est utilisé au jour 5-6. 7. bactérienne commensale ou pathogène e. coli Un jour avant d’effectuer l’infection, laver et nourrir les monocouches avec sans antibiotique EM ou DM. Utilisez une boucle de microbiologie stérile pour gratter la surface d’un stock de glycérol bactérienne congelés en douceur et inoculer 2 mL du bouillon LB. Transférer le tube à une norme secouant l’incubateur à 37 ° C pendant 12 à 16 h. Diluer 50 μL de la culture starter en bouillon LB fraîche de 5 mL (1/100) et poursuivre l’incubation avec la secousse pendant 90 min. Cela donnera une culture en phase avec une densité de 105-106 unités formant colonie (UFC) log / mL. Vous pouvez également confirmer la concentration bactérienne par mesure de la densité optique à 600 nm (DO600) dans un spectrophotomètre. Tournez en bas la culture bactérienne à 12 000 g pendant 10 min, retirez le surnageant et remettre en suspension les bactéries sans antibiotique EM ou DM à une concentration finale de 107 cfu/mL. Ajouter 10 μL de la suspension bactérienne à l’insert (concentration finale 106 UFC/mL). Pipette lentement à mélanger et à ne pas perturber la couche de mucus extracellulaire. Retourner la plaque à un incubateur de culture de tissus pour la période souhaitée de l’infection. 8. fixation pour préserver et réagissent du mucus Levée de la culture de cellules insère de la plaque 24 puits, inverser soigneusement sur un papier de soie de laboratoire pour enlever le milieu apical et essuyer le liquide externe away, s’accrochant à l’insert. Dans une nouvelle plaque 24 puits, plonger l’insert dans une solution de 1 / 3 d’acide acétique glacial dans de l’éthanol absolu (solution de Clarke) pendant 10 min à température ambiante. Inverser l’insert pour retirer le fixateur et réhydrater les cellules 1 x PBS pendant environ 10 minutes procédez avec protocoles immunostaining standard. Utiliser une lame de rasoir pour couper le long du périmètre de la membrane de l’insert. Transférer la membrane sur une lame de microscope de verre à l’aide de pinces et d’apposer une lamelle avec milieu de montage. 9. préparation des lysats cellulaires pour immunoblotting Remarque : Effectuez les opérations suivantes sur la glace ou dans une chambre froide. Moyen d’aspiration et lavage insèrent une fois avec du PBS. Ajouter 150 μL lyse tampon contenant inhibiteurs de la protéase (voir Table des matières) pour l’insertion et laisser reposer 5-10 min. tampon de lyse contient 50 mM Tris pH 8, NaCl 150 mM, 1 % IGEPAL CA-630, désoxycholate de sodium 0,5 %, 0,1 % SDS, inhibiteur de protéase au 1/100 cocktail. Utilisez un grattoir de cellules mini pour enlever les cellules de l’insert, puis utiliser une pipette de P200 pour triturer brièvement la suspension et transférez dans un tube de microcentrifuge. Laisser agir la suspension avec 5 x 1 s-Pulse à amplitude de 20 % à l’aide d’un applicateur microtip sonde (voir Table des matières). Ajouter tampon de charge SDS-PAGE, si vous effectuez immédiatement électrophorèse ou partie aliquote et stocker des lysats à-20 ° C.

Representative Results

Les cultures humaines d’enteroid et colonoid sont cultivées en tant que structures 3D, puis dissociées et fragmentées pour le placage sur les inserts de culture cellulaire IV-enduit de collagène humain. L’état d’avancement de la formation de monocouches est facilement contrôlée quotidiennement via au microscope à fond clair, immunofluorescence souillant (Figure 1) et par une augmentation constante résistance électrique transépithélial (TER) (Figure 2), qui reflète la perméabilité des jonctions imperméables aux ions et est corrélée avec la confluence de la monocouche. Le TER d’un insert de 24 puits vide est environ 50-100 Ω·cm2et en arrivant à confluence est passée à environ 400-500 Ω·cm2. Toutes les cellules épithéliales de monocouches confluentes sont reliées par des complexes de jonction détectés par l’anneau de l’actine F au périmètre de la cellule (Figure 1). Monocouches en pleine croissance facteur médias représentent l’épithélium ressemblant à des cryptes proliférative se compose principalement de cellules qui incorporent les nucléosides se divisant activement EdU analogique (Figure 2). Retrait de WNT3A et RSPO1, les facteurs de croissance favorise la différenciation, conduisant à des cultures de villosités semblables qui n’ont pas les cellules en prolifération. Monocouches différenciées contiennent des entérocytes (enteroids) ou les colonocytes (colonoids) et développent des cellules épithéliales intestinales spécialisées, comme l’a montré dans les cultures 3D,18 , y compris les cellules caliciformes et entéroendocrines. 15 dissociés monocouches montrent aussi une augmentation significative de TER (> 1000 Ω·cm2) (Figure 2), indiquant des jonctions serrées matures. Dans la physiologie humaine normale, la couche épithéliale intestinale sépare les nutriments et l’espace Luminale microbe enrichie de l’environnement de séreux stérile. L’épithélium réglemente étroitement la diaphonie entre ces deux compartiments. Enteroid et colonoid monocouches préserver cette propriété importante compartimentation comme en témoigne l’analyse protéomique dans Table 1. Il y a des différences importantes entre la composition en protéines en apicale et basolatérale conditionné médias prélevés monocouches enteroid différenciée. Accès aux deux côtés apicales et basolatérale permet pour la collecte de ces deux surnageants de manière dépendante de temps pour la mesure de différentielle sécrétion d’autres molécules telles que les cytokines et chimiokines. 15 , 17 Monocouches sont des modèles hautement reproductibles et pratiques pour détecter les changements dans l’expression de la protéine utilisant l’immunotransfert et immunostaining. Ainsi, change en mucine 2 (MUC2) expression de Sharn knockdown (KD) peut être détectée à l’aide de deux techniques (Figure 3). La transduction de Sharn a été effectuée sur colonoids 3D et maintenue dans les médias de l’antibiotique de choix. Après avoir vérifié le KD, colonoids peut être continuellement maintenu en tant que cultures 3D et/ou plaqué comme monocouches à des fins expérimentales. En outre, MUC2 KD n’affecte pas l’efficacité de la formation de monocouches par rapport à la ligne de colonoid parentale de type sauvage. Collection de monocouches pour immunoblotting est simple et similaire aux protocoles décrits pour des lignées cellulaires humaines de dérivés adénocarcinome épithélial. En général, environ 50 µg ou plus de protéines totales peuvent être extraites d’une monocouche d’insert cultivé seul 0,33 cm2 . Comme illustré à la Figure 3, MUC2 est à peine détectable dans les monocouches de colonoid (UD) WT indifférenciées, mais est fortement exprimée dans les monocouches (DF) WT différenciées. MUC2 est au-dessous du niveau de détection dans les UD et DF colonoid monocouches transduites avec MUC2 Sharn. Ce qui est important, monocouches sont un modèle approprié pour l’étude des interactions hôte-microbienne à la surface apicale de l’épithélium. Les monocouches de Colonoid forment une épaisse couche de mucus MUC2 séropositifs attachée à la différenciation, ce qui n’est pas facilement imprégnée par commensal bactéries e. coli HS (Figure 4), similaires à ce qui a été indiqué dans le côlon humain normal. 19 toutefois, entérohémorragique Escherichia coli (EHEC), un pathogène du côlon humain, s’est avéré ont la capacité de détruire la couche de mucus ci-joint MUC2 enrichi pour atteindre la surface apicale de l’épithélium (Figure 4). 14 , 20 MUC2 restants n’est présent que dans les cellules caliciformes. Figure 1 : Mise en place d’humains monocouches d’enteroid/colonoid. (A) exemple de colonoid des fragments après la dissolution du BMM et la trituration. (B) exemple d’insertion immédiatement après colonoid fragments de placage. L’échelle bar (A-B) = 200 μm. Représentante projection d’intensité maximale (C) et (D) confocal Z-coupe optique avec les projections orthogonales correspondantes montrent que des fragments de colonoid ensemencé sur formulaire IV-enduit filtres collagène humain plusieurs îles monocouche 2-4 jours après l’ensemencement. Zones exemptes de cellule (astérisque) sont identifiables par l’absence des deux nucléaire (Hoechst 33342, bleu) et apical actine F (phalloïdine, verte) coloration en C et D. représentant projection d’intensité maximale (E) et (F) confocal optique section avec les projections orthogonales correspondantes montrent une monocouche confluente colonoid avec surface apicale continue détectée par l’actine F immunostaining environ 1 semaines après semis. (G) fort grossissement d’une projection représentatif d’intensité maximale et la coupe optique confocal à (H) avec les projections orthogonales correspondantes montrent que les cellules en monocouches confluentes colonoid forment l’actine-F perijunctional anneaux (flèche blanche) et une bordure en brosse apicale immatures (têtes de flèche jaune). L’échelle bar (C-H) = 20 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2 : évaluation de la différenciation de la monocouche enteroid/colonoid. (A) l’incorporation EdU (rouge) montre une perte progressive de prolifération au cours de la différenciation monocouche jéjunale. (B) les mesures de moyen TER en monocouches confluentes jéjunales dans un milieu d’expansion ou de différenciation. Barres d’erreur représentent SEM. UD, indifférencié ; DF, différencié. Les numéros correspondent aux jours en vertu de la condition spécifiée ; Ud1 était le premier jour de confluence, environ 1 semaine après le semis. (C) monocouches jéjunale UD ont des cellules larges, plus courtes et une bordure de moins-mures apicale axée sur l’actine brosse que DF J5 jéjunale des monocouches. L’échelle bar (A, C) = 50 μm. Tous les monocouches ont représenté au moins 1 semaine après l’ensemencement et étaient confluentes avant le début de la différenciation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Colonoids de type sauvage et Sharn transduites knockdown (KD) colonoids chaque monocouches confluentes forme. (A) images représentatives de type sauvage (WT) humaine colonoid confluentes monocouche différencient pour 5 jours et (B) de même cultivés monocouches issu de cultures colonoid MUC2 KD. L’échelle bar (A-B) = 50 μm (C) représentant immunoblot des cultures colonoid transduites avec Sharn brouillé ou MUC2 Sharn montre que les changements dans l’expression de la protéine en raison de KD peuvent être dosés par immunoblot. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Enteroid/colonoid monocouches sont des modèles appropriés pour étudier les interactions hôte-microbe Luminale. Projection représentatif d’intensité maximale (A) et une coupe optique orthogonale d’une monocouche de colonoid montre l’épaisse couche de mucus MUC2 séropositifs apicale qui n’est pas perméable à e. coli HS (flèches noires) assis à la glaire apicale surface. La monocouche a été infectée pendant 6 heures avec 106 UFC/mL HS. (B) projection d’intensité maximale représentant de colonoid humaine monocouche apicalement infecté par EHEC (106 UFC/mL, 6 heures). L’échelle bar (A-B) = 50 μm. (C) mesures d’intensité MUC2 immunofluorescence montrent une diminution significative MUC2 en monocouches infectées par EHEC colonoid par rapport aux témoins sains. Barres d’erreur représentent SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Protéine Numéro d’acquisition Abondance de peptide Basolatérale Media protéine liant l’acide gras, du foie [Homo sapiens] NP_001434.1 1299 profilin-1 [Homo sapiens] NP_005013.1 797 précurseur de l’apolipoprotéine A-IV [Homo sapiens] NP_000473.2 744 Ecto-ADP-ribosyltransférase 4 précurseur [Homo sapiens] NP_066549.2 633 glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase isoforme 1 [Homo sapiens] NP_002037.2 (+ 1) 616 serotransferrin précurseur [Homo sapiens] NP_001054.1 (+ 1) 572 précurseur de vitamine D-liaison protéique isoforme 3 [Homo sapiens] NP_001191236.1 (+ 2) 567 catalase [Homo sapiens] NP_001743.1 427 agrin isoforme 1 précurseur [Homo sapiens] NP_940978.2 (+ 1) 377 précurseur de l’isoforme 1 lactotransferrin [Homo sapiens] NP_002334.2 (+ 1) 262 Les médias apicales précurseur de facteur 3 de trèfle [Homo sapiens] NP_003217.3 326 précurseur de facteur 1 trèfle [Homo sapiens] NP_003216.1 304 membrane basale spécifiques héparane sulfate protéoglycane core isoforme de la protéine précurseur [Homo sapiens] NP_001278789.1 (+ 3) 303 isoforme filamine B 1 [Homo sapiens] NP_001157789.1 (+ 2) 240 précurseur de facteur 2 de trèfle [Homo sapiens] NP_005414.1 182 supprimé dans cerveau malignes des tumeurs 1 protéine isoforme b précurseur [Homo sapiens] NP_015568.2 (+ 3) 169 la kératine, de type II du cytosquelette 1 [Homo sapiens] NP_006112.3 157 la myosine-9 [Homo sapiens] NP_002464.1 150 aminopeptidase N précurseur [Homo sapiens] NP_001141.2 (+ 1) 145 agrin précurseur [Homo sapiens] NP_940978.2 (+ 1) 112 Le tableau 1. Une liste partielle des peptides identifiés par spectrométrie de masse chromatographie/tandem liquide en apicale et fluides basolatérale prélevées différenciés jéjunale monocouches.

Discussion

Les paramètres critiques pour une formation réussie d’enteroid/colonoid monocouches comprennent 1) sain, prolifèrent 3D cultures comme des matériaux ; 2) revêtement de la surface d’insert de culture cellulaire avec collagène humain IV avant l’ensemencement de monocouche ; 3) fragmentation de 3D cultures soit mécaniquement, soit par voie enzymatique, mais pas au niveau de la cellule unique.

Lors de l’isolation de 3D enteroids/colonoids, la vitesse d’agitation optimale peut varier selon le diamètre de rotation d’un modèle donné de shaker. Le but est non seulement agiter la plaque pour un mixage efficace, mais pour également éviter les éclaboussures de la suspension cellulaire sur la plaque de couverture ou dans des puits adjacents. Périodes d’incubation de 30 min < peuvent donner BMM résiduelle s’accrochant aux cellules, qui peuvent entraver la pièce jointe et formation de monocouches de cellules uniformes lorsque plaqué sur les insertions. Une incubation (≥ 1 h) produira la viabilité cellulaire une baisse significative.

L’étendue de la trituration pour dissocier 3D enteroids/colonoids peut varier avec dextérité rigidité et utilisateur de piston. Examen périodique du contenu bien sur un microscope optique à contraste de phase est recommandée pour déterminer l’uniformité de fragment au cours de la trituration, dans le but d’environ 30 cellules par fragment. Au lieu de, ou en plus de la trituration, la suspension peut être digérée brièvement avec la trypsine pour obtenir de plus petits fragments d’uniformes. Digest de la trypsine peut être souhaitable si monocouches contiennent une proportion importante des structures en 3D parmi une couche épithéliale sinon unique. Cependant, dissociation de cellules individuelles n’est pas souhaitable car cela diminue de manière significative la viabilité cellulaire. Un puits d’enteroids/colonoids, cultivées dans une gouttelette BMM 35 μL sera généralement suffisant pour remplir les insertions de 2-3, mais ce facteur peut varier selon le nombre et la taille moyenne de l’enteroids/colonoids.

Colonoid monocouches peuvent absorber un volume important du milieu apical car ils se différencient. Ceci peut être contourné en appliquant DM supplémentaire à la chambre supérieure insert (150-200 μL), bien que le séchage partiel de la chambre haute ne semble pas nuire à la viabilité de monocouche ou fonction lors d’essais en aval. Après environ 4-5 jours de la différenciation, monocouches colonoid développent des mucus extracellulaire qui peut apparaître comme un matériel épais/gélatineux à la surface cellulaire après aspiration minutieuse de DM.

Pour l’interaction de EHEC avec la couche muqueuse extérieure, nous utilisons régulièrement la période d’incubation et de titre bactérienne, spécifiée dans le protocole. Cependant, des souches bactériennes uniques doivent initialement être dosés à plusieurs des concentrations et des périodes d’incubation pour déterminer les paramètres appropriés pour l’effet désiré.

Durant la fixation de mucus, aspirer le milieu apical supprimera probablement la plus grande partie de la couche de mucus seules extracellulaire. Par conséquent, il est important de verser délicatement sur le milieu. Si le milieu est conservé dans le foyer de tension superficielle, utilisez le coin d’un mouchoir en papier plié de laboratoire pour casser la tension superficielle et évacue la plupart du milieu. Après fixation et coloration, la couche muqueuse peut être délogée involontairement ou aplatie en une lamelle de montage sur le filtre de l’insert. Pour conserver la hauteur de mucus, placer le filtre sur une baisse des supports de montage et placer soigneusement la lamelle sur le filtre. Ne touchez ni appuyer sur la lamelle comme cela peut considérablement aplatir la couche muqueuse.

Pour former une monocouche polarisée de cellules en culture 3D, il est nécessaire de reproduire l’interaction entre les intégrines membrane basolatérale des cellules épithéliales intestinales et les protéines de la matrice extracellulaire (ECM). Laminine, collagène IV, fibronectine et un tableau des protéoglycanes constituent l’ECM épithéliale intestinale. 21 , 22 nous avons comparé humaine culture cellulaire laminine, fibronectine, collagène IV et dérivés murin BMM comme revêtements de l’insert. Seulement le collagène IV pris en charge la formation de stable, à long terme (jusqu’à 4 semaines) monocouches confluentes d’enteroid/colonoid (Figures 1-2). Petites parcelles de croissance de type monocouche ont été obtenues sur chacun des autres matrices testées, mais ces régions n’a pas pu progresser jusqu’à la confluence. Utilisation de collagène humain IV comme le substitut de l’ECM a un certain nombre d’avantages. BMM dérivé de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) cellules de sarcome murin ne sont pas d’origine humaine, alors que le collagène humain IV est disponible dans le commerce et en général plus rentable. En outre, le BMM est un mélange complexe de protéines avec une variabilité inhérente et peut-être contenir des facteurs de croissance sécrétés par les sarcomes qui influent sur l’expression des gènes. 23

Interactions entre les cellules épithéliales intestinales et l’ECM sous-jacent en restitution épithéliale intestinale est encore incomplètement compris. L’importance du collagène IV, mais pas de laminine, comme un ligand d’adhérence pour les colonocytes humains24 et exhausteur de cryptes intestinales cellules épithéliales restitution25 a suggéré à l’aide d’anticorps dirigés contre le collagène IV qui empêchait la pièce jointe . Épithéliales exprimés β1-intégrine semble être importante pour l’interaction de l’ECM, comme un anticorps spécifique pour β1-intégrine bloqué significativement adhérence des colonocytes taper le collagène IV. 24 alors que le collagène IV fournit un ECM fiable pour enteroid/colonoid monocouche, formation sur plaquettes, épithéliales remodelage de l’ECM au fil du temps n’a pas encore été évaluée dans ce modèle, ni a l’influence des mélanges de ECM plus complexes et définis de le collagène IV, laminine et la fibronectine.

Enteroids/colonoids humaines au format monocouche (Figures 1-4) permettent des manipulations et d’échantillonnage qui seraient difficiles à appliquer ou impossibles à réaliser en utilisant des cultures incorporés matrice 3D. 3D enteroids/colonoids varient en taille, la complexité structurelle et volume luminal, et donc microinjection de microbes ou de petites molécules sont difficiles à quantifier avec précision. En outre, par contraste avec les monocouches (tableau 1), cultures 3D empêchent l’accès direct à des surfaces luminales et basolatérale pour mesurer les ions, nutriments, cytokines ou des facteurs sécrétés associés aux processus physiologiques ou physiopathologiques . Confluence (Figures 1-2) est l’une des propriétés principales de la monocouche enteroid/colonoid nécessaire pour établir non seulement les gradients physiologiques des éléments nutritifs, les ions et autres macromolécules,16 , mais également de créer la barrière adéquate entre microbiote Luminale et stériles mésenchymateuses/immunitaire cellulaire peuplées séreux environnements. Ces facettes sont importants à considérer pour les études futures qui incorporent les monocouches d’enteroid/colonoid avec des types de cellules mésenchymateuses, immunitaires ou neuronale pour construire des modèles physiologiques plus complexes.

Des limites indiqués du modèle d’insert de culture cellulaire décrit ici comprennent manque de forces physiques telles que la contrainte de cisaillement fluide et stretch/compression mécanique (péristaltisme) et l’absence d’un environnement anaérobie apical, normalement connu par intestinale épithéliums in vivo. Ces éléments sont susceptibles de s’attaquer à plus sophistiqué microphysiological plates-formes,26 , mais ils exigent également des frais supplémentaires, l’équipement et expertise pour mettre en œuvre. 3D et monocouche cultures sont également sans interactions avec ou de contributions versées par le microbiome intestinal, les populations de cellules stromales et le système immunitaire à moins que ces composants sont ajoutés volontairement.

Les applications futures de la monocouche enteroid/colonoid sur les inserts de culture cellulaire IV-enduit de collagène peuvent inclure d’autres études d’interaction microbienne pathogène ou commensale, absorption de drogues ou des éléments nutritifs, toxicité, métabolisme, fonction de barrière et fonctionnel amélioration catalysée par co-culture avec des types de cellules intestinales supplémentaires. Évaluations peuvent être faites non seulement au sein de l’épithélium de donneurs sains, mais aussi de personnes ayant des mutations génétiques ou des troubles intestinaux, pourvu que les phénotypes in vivo sont établis à conserver en ex vivo enteroid/colonoid culture.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par les NIH subventions P01 AI125181, K01 DK106323 (JGI) et K01 DK113043 (JFA). Nous remercions James Kaper (Université du Maryland, Baltimore, MD, é.-u.) pour la fourniture d’e. coli de souche HS et EHEC. Nous remercions également la physiologie intégrée et les noyaux d’imagerie de l’Hopkins Conte Digestive maladie Basic et centre de base de recherche translationnelle (P30 DK089502) et la Johns Hopkins spectrométrie de masse et protéomique Core.

Materials

2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol Sigma T4661 Tris base, Component of lysis buffer
A-83-01 Tocris 2939 ALK4/5/7 inhibitor
Acetic acid, glacial Fisher Scientific A38
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634-010 Component of growth medium
Alexa Fluor 488 phalloidin Life Technologies A12379 Fluorescent probe for F-actin
Antibiotic/antimycotic cocktail Invivogen ant-pm-2 Primocin (100x)
B27, 50x Life Technologies 17504-044 Component of growth medium
Cell culture inserts Corning 3470 Transwell, PET membrane, 0.4 μm pore, 24-well plate
CHIR 99021 Tocris 4423 GSK3β inhibitor
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit Life Technologies C10639
Collagen IV, from human placenta Sigma C5533
Cultrex Organoid Harvesting Solution Trevigen 3700-100-01 Depolymerizes basement membrane matrix
Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) Kaper lab, University of Maryland
Epithelial voltohmmeter World Precision Instruments EVOM2
Epithelial voltohmmeter electrode World Precision Instruments STX3
Escherichia coli strain HS Kaper lab, University of Maryland
Ethanol, absolute Pharmco 111000200
FluorSave mounting medium Millipore 345789 For mounting insert membrane on microscope slide
GlutaMAX Life Technologies 35050-061 L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 200 mM
HEK293T/Noggin-Fc cell line van den Brink lab, Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research For production of Noggin conditioned medium
HEK293T/RSPO1-Fc-HA cell line Trevigen 3710-001-K For production of Rspondin-1 conditioned medium
HEPES, 1 M Life Technologies 15630-080 Component of growth medium
Heraeus Multifuge X1R Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004250
Hoechst 33342 Life Technologies H3570 Fluorescent nuclear dye
Human epidermal growth factor (EGF) R&D Systems 236-EG-01M Component of growth medium
IGEPAL CA-630 Sigma I8896 Component of lysis buffer
Inverted cell culture light microscope Olympus CKX51
LB broth EMD Millipore 1.10285.0500
L-WNT3A cell line ATCC CRL-2647 For production of Wnt3a conditioned medium
Matrigel, growth factor reduced Corning 356231 Basement membrane matrix for 3D culture
Mini cell scraper United BioSystems MCS-200
MUC2 antibody, mouse monoclonal Abcam ab11197 Use at 1:100 for immunostaining, 1:500 for immunoblotting
MUC2 shRNA lentiviral particles GE Dharmacon RHS4531 GIPZ lentiviral shRNA, ID: 4583
Orbital shaker Grant Instruments PSU-10i
Penicillin-streptomycin, 100x Life Technologies 15140-122 Component of growth medium
Phosphate buffered saline Corning 21-031
Probe sonicator with microtip Branson Ultrasonics 450
Protease inhibitor cocktail for mammalian cells Sigma P8340 Component of lysis buffer
SB 202190 Tocris 1264 p38 MAPK inhibitor
Sodium chloride Sigma S3014 Component of lysis buffer
Sodium dexoycholate Sigma D6750 Component of lysis buffer
Sodium dodecyl sulfate Sigma L3771 Component of lysis buffer
TrypLE Express, 1x Life Technologies 12605-010 Trypsin, for digesting enteroid/colonoid fragments
Vinculin antibody, rabbit monoclonal Abcam ab129002 Use at 1:1000 for immunoblotting
Water, tissue culture grade, sterile filtered Corning 25-055
Y-27632 Tocris 1254 RhoA/ROCK inhibitor
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References

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In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium. J. Vis. Exp. (146), e59357, doi:10.3791/59357 (2019).
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