Автоматизированная 3D оптическая когеренционная томография для выяснения биофильма Morphogenesis над большими пространственными весами

Биопленки являются весьма успешной адаптации микробного образа жизни и эти межфазные и матричные закрытые сообщества микроорганизмов доминируют микробной жизни в естественных и промышленных условиях^1,2. Там, биопленки образуют сложные архитектуры, такие как удлиненные растяжки³, рябь⁴ или грибоподобные колпачки⁵ с важными последствиями для роста биопленки, структурной стабильности и устойчивости к стрессу⁶. Хотя многое о биопленки структурной дифференциации было извлечено из работы по моновидовкультуры, выращенные в миниатюрных камер потока, большинство биофильмов очень сложных общин часто в том числе членов всех областях жизни⁶. Оценивая эти сложные биопленки как микробные ландшафты⁷ и понимание того, как структура и функция биопленки взаимодействуют в сложных сообществах, таким образом, находится на переднем крае исследований биопленки.

Механистическое понимание морфогенеза сложных биопленок в ответ на экологические сигналы требует тщательно разработанных экспериментов в сочетании с пространственно и временно решенными наблюдениями биопленки физической структуры по всей актуальности весы⁸. Однако неразрушающие наблюдения за ростом биопленки в экспериментальных системах были серьезно ограничены такими логистическими ограничениями, как необходимость перемещения образцов (например, в микроскоп), часто повреждающих тонкую структуру биопленки.

Представленный здесь протокол вводит полностью автоматизированную систему, основанную на оптической когеренционной томографии (ОКТ), которая позволяет вести неинвазивный мониторинг биопленогенеза в мезомасштабе (мм диапазоне). OCT является новой техникой визуализации в биопленки исследований с приложениями в области очистки воды и биофоллинг исследований, медицины⁹ и потока экологии¹⁰. В OCT источник света с низкой согласованностью делится на образец и эталонную руку; анализируется интерференция света, отраженного и рассеянного биопленкой (образец руки), и свет эталонной руки. Серия профилей интенсивности осевой нагрузки (A-scans), которая содержит глубоко решенную структурную информацию, приобретается и сливается в B-сканирование (сечение). Серия смежных B-сканов составляет окончательный 3D объем сканирования¹⁰. OCT обеспечивает боковое оптическое разрешение в диапазоне около 10 мкм и поэтому хорошо подходит для изучения мезоскопической структурной дифференциации биопленок^10,12. Для более подробного описания OCT, обратитесь к Drexler и Fujimoto¹³и Ферчер и коллеги¹⁴. Хотя поле зрения одного OCT xy-scan достигает сотен квадратных микрометров, более крупные модели не могут быть количественно оценены с помощью OCT в одном сканировании. Что касается биопленки в естественных средах обитания, таких как ручьи и реки, это в настоящее время ограничивает нашу способность оценивать биопленки морфогенеза в масштабах, соответствующих физическому и гидравлическому шаблону среды обитания.

Для того, чтобы превзойти эти пространственные пределы и автоматически приобрести ОКТ сканирование, спектральный домен OCT imaging зонд был установлен на 3-осевой системы позиционирования. Установка позволяет получить несколько OCT сканирования в перекрывающихся мозаики картины (плитка сканирования), эффективно достижения томографической визуализации поверхностных участков до 100 см². Кроме того, высокая точность позиционирования этой системы позволяет надежно контролировать рост и развитие функций биопленки на конкретных участках во время длительных экспериментов. Система является модульной и отдельные компоненты (наоборот, позиционирование устройства и OCT) установки могут быть использованы в качестве автономных решений или гибко сочетаются. Рисунок 1 предоставляет обзор жестких и программных компонентов установки.

Система была протестирована с коммерчески доступным GRBL-контролируемым устройством позиционирования CNC(Таблицаматериалов). Рабочие расстояния этой конкретной платформы позиционирования составляют 600-840-140 мм, с указанной производителем точностью 0,05 мм и программируемым разрешением 0,005 мм. GRBL является открытым исходным кодом (лицензия GPLv3), высокопроизводительным управлением движением для CNC Устройств. Таким образом, каждый GRBL основе (версия Nogt; 1.1) позиционирование устройство должно быть совместимо с руководящими принципами и пакетами программного обеспечения, представленных здесь. Кроме того, программное обеспечение может быть адаптировано к другим stepmotor контроллеров с STEP-DIR ввода типа с несколькими изменениями.

Устройство OCT, используемое для оценки производительности системы(Таблица материалов) имеет низкий источник слаженный свет с центральной длиной волны 930 нм (ширина пропускания 160 нм) и регулируемой длиной и интенсивностью эталонной руки. В приведенном здесь примере также использовался адаптер погружения для погружения зонда OCT в протекающую воду(ТаблицаМатериалов). Программное обеспечение пакет, разработанный здесь для автоматизированного приобретения сканирования ОКТ критически зависит от SDK, предоставляемых вместе с конкретной системой OCT, однако, OCT систем ы от того же производителя с различными сканирования линз и центральной длины волн должны быть легко совместимы.

Устройство GRBL управляется веб-сервером, установленным на однобортном компьютере(рисунок 1). Это предоставляет пульт дистанционного управления устройством с любого компьютера с локальной сетью или доступом в Интернет. Устройство OCT управляется отдельным компьютером, что позволяет работать с системой OCT в сторону автоматизированной экспериментальной настройки. Наконец, пакеты программного обеспечения включают библиотеки для синхронизации позиционирования зонда OCT и приобретения сканирования OCT (т.е. для автоматического приобретения наборов данных 3D-изображений в мозаичном шаблоне или в наборе определенных позиций). Определение положения зонда OCT в 3D эффективно позволяет настроить фокусную плоскость специально для (региональных) наборов сканирований. В частности, на неровных поверхностях для каждого сканирования OCT могут быть указаны различные фокусные плоскости (т.е. различные положения в направлении z).

Набор программных пакетов был разработан для обработки необработанных ОКТ-сканирований(таблица 1). Навигация устройства позиционирования, приобретение сканирования OCT и обработка наборов данных выполняются с помощью ноутбуков Jupyter с кодовым кодом Python, которые обеспечивают замечательную гибкость в разработке и оптимизации программного обеспечения. Два отработанных и аннотированных примера таких тетрадей (для приобретения изображений и обработки, соответственно) доступны из https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git Они предназначены в качестве отправных точек для настройки метода. Ноутбук Jupyter — это приложение на основе веб-браузера, которое содержит ячейки с аннотированным кодом Python. Каждый шаг содержится в ячейке блокнота, который может быть выполнен отдельно. Из-за разной длины светового пути через скан-объектив (сферическая аберрация)¹⁵, сырые сканирование OCT появляются искаженными(рисунок 2A). Мы разработали алгоритм для автоматического исправления этого искажения в приобретенных OCT сканирования (содержится в ImageProcessing.ipynb, Дополнительный файл 1). Кроме того, биопленка морфологии может быть визуализирована как 2D карта высоты, как это было ранее используется в мембранных систем¹⁶, и мы иллюстрируем, как высота карты, полученные от сканирования, принятых в плиточный массив могут быть сшиты.

Наконец, функциональность описанной лабораторной установки иллюстрируется с помощью эксперимента с флеймом, в котором биопленка фототрофического потока подвергается градиенту скорости потока.