אוטומטי 3D הטומוגרפיה האופטית קוהרנטית כדי להבהיר ביויובואר מורפוגנזה מעל סולמות מרחביים גדול
Summary
ביויודים מורכבים באופן מורכב מארכיטקטורות מורכבות ומתפתחות לדפוסי מרחבי מאוד תלויי קנה מידה. כאן, אנו מציגים מערכת ניסיונית (קשה ותוכנה) עבור רכישה אוטומטית של מערכות הנתונים של טומוגרפיה אופטית 3D קוהרנטית (OCT). ערכת כלים זו מאפשרת אפיון לא פולשני ורב-ממדי של הביוגנזה מורפוליולוגיה במרחב ובזמן.
Abstract
ביואילאמים הם אורח חיים מוצלח ביותר בחיידקים ומנצח בהמון הגדרות סביבתיות ומהונדסים. הבנת המבנה הקונסטרוקטיבי של ביואוגנזה, שהיא הגיוון המבני של ביוילאמים במהלך האסיפה הקהילתית, מייצגת אתגר יוצא דופן על פני קשקשים מרחביים וזמני. כאן, אנו מציגים מערכת הדמיה אוטומטית של ביואוilm המבוססת על טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT). OCT היא טכניקת הדמיה מתפתחים בתחום המחקר הבין-מחקרי. עם זאת, כמות הנתונים שניתן לרכוש כרגע ולעבד הסלים את הסקנה הסטטיסטית של דפוסי בקנה מידה גדול בתוך המבנה הבין-מורפולוגיה. מערכת ההדמיה האוטומטית של OCT מאפשרת לכסות את היקף הריבוי והארוך של צמיחת הביוilm. הוא משלב מערכת מסחרית הזמין OCT עם פלטפורמת מיצוב רובוטית וחבילת פתרונות תוכנה כדי לשלוט על המיקום של בדיקה סריקת OCT, כמו גם רכישת ועיבוד של ערכות נתונים 3D הדמיה של ביוilm. התקנה זו מאפשרת באתרו ובמעקב אוטומטי לא פולשנית של פיתוח הביוilm וניתן לפתח עוד ליצירת הדמיה של שני OCT עם מאקרוצילום ופרופיל מיקרוסנסור.
Introduction
ביואילאמים הם הסתגלות מוצלחת ביותר לסגנון חיים של חיידקים והקהילות הללו הקשורות ומטריצה משולבת של מיקרואורגניזמים להשתלט על החיים מיקרוביאלית בהגדרות טבעיות ותעשייתיים1,2. שם, ביוגיאמים יוצרים ארכיטקטורות מורכבות, כגון סרטים מאורכים3, אדוות4 או פטריות כמו כמוסות מסוג5 עם השלכות חשובות לגידול ביוilm, יציבות מבנית ועמידות ללחץ6. בעוד הרבה מאוד על בידול מבנית לומדים מהעבודה על תרבויות מונו-מינים גדל בתאי זרימה זעירים, רוב הביואמים הם קהילות מורכבות לעתים קרובות כולל חברים של כל תחומי החיים6. מעריך את הביואמים המורכבים הללו כנופי מיקרוביאלית7 ומבינים כיצד מבנה ותפקוד של ביוilm מקיימים אינטראקציה בקהילות מורכבות, ולכן בחזית המחקר של הביו,.
הבנה מכניסטית של מורפוגנזה של ביווריאמים מורכבים בתגובה לרמזים סביבתיים מחייבת ניסויים מעוצבים בקפידה בשילוב עם תצפיות הקשורות באופן זמני ומעמיק של מבנה פיסי של ביויוסיס על-פני מאזניים8. עם זאת, התבוננות בלתי הרסנית של גידול ביוilm במערכות נסיוניות הוגבלה באופן חמור באילוצים לוגיסטיים, כגון הצורך להעביר דגימות (למשל, למיקרוסקופ), הפוגעות לעתים קרובות במבנה הבין-ממדי העדין.
הפרוטוקול המוצג כאן מציג מערכת אוטומטית לחלוטין מבוסס על טומוגרפיה אופטית קוהרנטית (OCT), אשר מאפשר את באתרו, לא פולשנית ניטור של ביואוסיס מורגנזה בקנה מידה מזולא (מגוון מ”מ). OCT היא טכניקת הדמיה מתפתחים בתחום המחקר של הארגון, עם יישומים בטיפול במים ומחקר ביומיים, רפואה9 ואקולוגיה של זרם10. ב-OCT, מקור אור קוהרנטיות נמוך מפוצל למדגם וזרוע התייחסות; הפרעה של האור המשתקף והתפזרו על-ידי היוilm (הזרוע המדגם) והאור של זרוע ההתייחסות מנותח. סדרה של פרופילים בעלי עוצמה צירית (A-סריקות) אשר מכיל מידע מבני הנפתרות בעומק מעמיק נרכש וממוזג לתוך סריקת B (חתך רוחב). סדרה של B-סריקות סמוכות מלחינה האחרון 3D לסרוק את העוצמה10. OCT מספק רזולוציה אופטית לרוחב בטווח של כ 10 יקרומטר ולכן מתאים במידה רבה ללמוד בידול מבניים מזוסקופי של ביוילמס10,12. לתיאור מפורט יותר של OCT, עיין דרקסלר ופוג’ימוטו13ו fercher ועמיתיו14. למרות ששדה-התצוגה של ציר xy אחד של OCT מגיע עד מאות מיקרומטר רבועים, לא ניתן לכמת תבניות בקנה מידה גדול יותר באמצעות OCT בסריקה אחת. ביחס לבייואמים בבתי גידול טבעיים כגון נחלים ונהרות, הדבר מגביל כיום את היכולת שלנו להעריך את המבנה הפיזי והידראולי של בית הגידול.
על מנת לעבור את המגבלות הללו מרחבי ולרכוש באופן אוטומטי בסריקות OCT, בדיקה ספקטרלית בתחום הדמיה OCT הותקן על מערכת מיצוב של 3 צירים. ההתקנה מאפשרת רכישה של מספר סריקות OCT בתבנית פסיפס חופפת (סריקת אריח), השגת ביעילות את ההדמיה הטומוגרפית של שטחי פני השטח עד 100 ס מ2. יתרה מזאת, דיוק המיקום הגבוה של מערכת זו מאפשר לנטר באופן אמין את התפתחותם והתפתחותם של תכונות ביוilm באתרים ספציפיים במהלך ניסויים ארוכי טווח. המערכת היא רכיבים מודולריים ובודדים (כלומר, התקן מיקום ו-OCT) של ההתקנה ניתן להשתמש כפתרונות עצמאיים או בשילוב גמיש. איור 1 מספק מבט כולל על רכיבי התוכנה הקשיחים של ההתקנה.
המערכת נבדקה עם התקן מיקום מסחרי GRBL מבוקרת CNC (טבלת חומרים). מרחקים ההפעלה של פלטפורמת מיקום ספציפית זו הם 600 × 840 × 140 מ”מ, עם יצרן-המצוין בדיוק של +/-0.05 מ”מ ורזולוציה ניתנת לתיכנות של 0.005 mm. GRBL הוא מקור פתוח (GPLv3 רישיון), ביצועים גבוהים תנועה בקרת CNC תקנים. לכן, כל GRBL מבוסס (גירסה > 1.1) התקן מיקום צריך להיות תואם את ההנחיות וחבילות התוכנה המוצגת כאן. יתר על כן, התוכנה יכול להיות מותאם לבקרי מוטוריים אחרים עם סוג הקלט שלב-DIR עם כמה שינויים.
התקן OCT המשמש להערכת ביצועי המערכת (טבלת חומרים) כולל מקור אור קוהרנטיות נמוכה עם אורך גל מרכזי של 930 ננומטר (רוחב פס = 160 nm) והתייחסות מתכווננת באורך ובעוצמה. בדוגמה שהוצגה כאן, נעשה שימוש גם במתאם טבילה לטבילה במכשיר OCT למים זורמים (שולחן החומרים). חבילת התוכנה שפותחה כאן עבור רכישת הסריקה האוטומטית של OCT באופן ביקורתי תלוי ב-SDK סיפק יחד עם מערכת OCT ספציפית, עם זאת, מערכות OCT מאותו יצרן עם עדשות סריקה שונות ואורכי גל מרכזי צריך להיות תואם בקלות.
התקן ה-GRBL נשלט על-ידי שרת אינטרנט המותקן במחשב בעל לוח יחיד (איור 1). זה מעניק שליטה מרחוק של המכשיר מכל מחשב עם רשת מקומית או גישה לאינטרנט. התקן ה-OCT נשלט על-ידי מחשב נפרד, המאפשר לבצע את פעולת מערכת OCT מחוץ לכיוונון הניסיוני האוטומטי. לבסוף, חבילות התוכנה כוללות ספריות כדי לסנכרן מיצוב בדיקה OCT ו-OCT הסריקה לסרוק (כלומר, כדי לרכוש באופן אוטומטי מערכות הדמיה תלת-ממד בתבנית פסיפס או בסדרה של מיקומים מוגדרים). הגדרת המיקום של הבדיקה OCT ב-3D באופן יעיל מאפשר לכוונן את המטוס המוקד במיוחד עבור (אזורי) סטים של סריקות. במיוחד, על משטחים לא אחיד, מטוסי מיקוד שונים (כלומר, תנוחות שונות בכיוון z) ניתן לציין עבור כל סריקת OCT.
ערכה של חבילות תוכנה פותחה כדי לעבד סריקות OCT raw (טבלה 1). ניווט של התקן המיקום, הרכישה של OCT ועיבוד ערכת נתונים מתבצעים עם מחשבים ניידים מקודד פיתון, אשר מאפשרים גמישות יוצאת דופן בפיתוח ואופטימיזציה של התוכנה. שתי דוגמאות עבדו ומבוארות של מחברות כאלה (לרכישת תמונות ועיבוד, בהתאמה) זמינות מ https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git הם מיועדים כנקודות התחלה עבור התאמה אישית של השיטה. מחברת Jupyter הוא דפדפן אינטרנט יישום המבוסס המכילים תאים עם קוד פיתון מסומן. כל שלב מכיל תא של המחברת, שניתן לבצע בנפרד. בשל האורך השונה של נתיב האור דרך עדשת הסריקה (סטייה כדורית)15, סריקות OCT raw מופיעות מעוותות (איור 2a). פיתחנו אלגוריתם כדי לתקן באופן אוטומטי לעיוות זה בסריקות OCT שנרכשו (הכלול בעיבוד imageprocessing ipynb, קובץ משלים 1). יתר על כן, מורפולוגיה ביוilm יכול להיות מדמיין כמפת העלאת 2D, כפי שהיה בעבר בשימוש מערכות ממברנה16, ואנו ממחישים כיצד העלאת מפות שהתקבלו מסריקות שצולמו מערך ריצוף יכול להיות תפור.
לבסוף, את הפונקציונליות של התקנת המעבדה המתוארת מומחש באמצעות ניסוי תעלת שבו phototrophic זרם ביוilm נחשף הדרגתי של מהירות הזרימה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הדמיה של OCT מתאימה היטב לפתרון מבנים בטווח המיקרומטר עם FOV של מספר מילימטרים רבועים. לפיכך, כלי רב-עוצמה עבור מחקר ביוilm10,18. עם זאת, OCT מוגבל כעת לשטח סריקה מירבי של 100-256 מ”מ2, בעוד שתבניות מבניות של ביוilm חורגות לרוב בקנה מידה מרחבי זה19, במיוחד …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למורסיו אגירי מוראלס. על תרומתו לפיתוח המערכת תמיכה פיננסית הגיעה מקרן המדע הלאומי השוויצרי לT.J.B.
Materials
| OCT Probe | Thorlabs | GAN210C1 | OCT imaging device |
| OCT scan lens | Thorlabs | OCT-LK3-BB | |
| Immersion adapter | Thorlabs | OCT-IMM3-SP1 | |
| Stepcraft 840 CK | STEPCRAFT | NA | positioning device |
| microcontroller | Arduino Uno R3 | NA | |
| Single-board computer | Raspberry PI | NA | |
| camera | Canon EOS 7D Mark II | NA | |
| camera lens | Canon MACRO EFS 35 mm | NA |
References
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature reviews. Microbiology. 8, 623-633 (2010).
- Flemming, H. -. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature reviews. Microbiology. 14, 563 (2016).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Oscillation characteristics of biofilm streamers in turbulent flowing water as related to drag and pressure drop. Biotechnology and Bioengineering. 57, 536-544 (1998).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. The formation of migratory ripples in a mixed species bacterial biofilm growing in turbulent flow. Environmental microbiology. 1, 447-455 (1999).
- Banin, E., Vasil, M. L., Greenberg, E. P. Iron and Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. Proceedings of the Natural Academy of Sciences U.S.A. 102, 11076-11081 (2005).
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Microbiology. 14, 251-263 (2016).
- Battin, T. J., et al. Microbial landscapes: new paths to biofilm research. Nature Reviews. Microbiology. 5, 76-81 (2007).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends in Microbiology. 23, 233-242 (2015).
- Meleppat, R. K., Shearwood, C., Seah, L. K., Matham, M. V. Quantitative optical coherence microscopy for the in situ investigation of the biofilm. J. of Biomedical Optics. 21 (12), 127002 (2016).
- Wagner, M., Horn, H. Optical coherence tomography in biofilm research: A comprehensive review. Biotechnology and Bioengineering. 114, 1386-1402 (2017).
- Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254, 1178-1181 (1991).
- Haisch, C., Niessner, R. Visualisation of transient processes in biofilms by optical coherence tomography. Water Resources. 41, 2467-2472 (2007).
- Drexler, W., Fujimoto, J. G. . Optical Coherence Tomography: Technology and Applications. , (2008).
- Fercher, A. F. Optical coherence tomography – development, principles, applications. Zeitschrift für Medizinische Physik. 20, 251-276 (2010).
- Lee, H. -. C., Liu, J. J., Sheikine, Y., Aguirre, A. D., Connolly, J. L., Fujimoto, J. G. Ultrahigh speed spectral-domain optical coherence microscopy. Biomedical Optics Express. , 41236-41254 (2013).
- Fortunato, L., Leiknes, T. In-situ biofouling assessment in spacer filled channels using optical coherence tomography (OCT): 3D biofilm thickness mapping. Bioresource Technology. 229, 231-235 (2017).
- Niederdorfer, R., Peter, H., Battin, T. J. Attached biofilms and suspended aggregates are distinct microbial lifestyles emanating from differing hydraulics. Nature Microbiology. 1, 16178 (2016).
- Roche, K. R., et al. Benthic biofilm controls on fine particle dynamics in streams. Water Resources. 53, 222-236 (2016).
- Fortunato, L., Jeong, S., Wang, Y., Behzad, A. R., Leiknes, T. Integrated approach to characterize fouling on a flat sheet membrane gravity driven submerged membrane bioreactor. Bioresource Technology. 222, 335-343 (2016).
- Morgenroth, E., Milferstedt, K. Biofilm engineering: linking biofilm development at different length and time scales. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 8, 203-208 (2009).
