Geautomatiseerde 3D optische coherentie tomografie om biofilm morfogenese te Verheldoen over grote ruimtelijke weegschalen

Biofilms zijn een zeer succesvolle microbiële leefstijl aanpassing en deze Interphase-geassocieerde en matrix-omsloten gemeenschappen van micro-organismen domineren microbiële leven in natuurlijke en industriële instellingen^1,2. Daar vormen biofilms complexe architecturen, zoals langwerpige streamers³, rimpelingen⁴ of champignon achtige Caps⁵ met belangrijke gevolgen voor de groei van de biofilm, structurele stabiliteit en weerstand tegen stress⁶. Terwijl veel over biofilm structurele differentiatie is geleerd van het werk op mono-species culturen geteeld in miniatuur stroom kamers, de meeste biofilms zijn zeer complexe gemeenschappen vaak met inbegrip van leden van alle domeinen van het leven⁶. Het waarderen van deze complexe biofilms als microbiële landschappen⁷ en begrijpen hoe biofilm structuur en functie samenwerken in complexe Gemeenschappen is dus in de voorhoede van biofilm onderzoek.

Een mechanistisch begrip van de morfogenese van complexe biofilms in reactie op omgevings aanwijzingen vereist zorgvuldig ontworpen experimenten in combinatie met ruimtelijk en tijdelijk opgeloste waarnemingen van biofilm fysieke structuur over relevante Weegschaal⁸. De niet-destructieve waarneming van de biofilm groei in experimentele systemen is echter ernstig beperkt door logistieke beperkingen, zoals de noodzaak om monsters te verplaatsen (bijv. naar een Microscoop) die vaak schadelijk zijn voor de delicate biofilm structuur.

Het hier gepresenteerde protocol introduceert een volledig geautomatiseerd systeem op basis van optische coherentie tomografie (OCT), dat de in-situ, niet-invasieve monitoring van biofilm morfogenese op het MESOSCHAAL (mm-bereik) mogelijk maakt. OCT is een opkomende beeldvormings techniek in biofilm onderzoek met toepassingen in waterzuivering en Biofouling-onderzoek, geneeskunde⁹ en stream Ecology¹⁰. In de LGO wordt een lichtbron met een lage coherentie opgesplitst in een monster-en referentiearm; de interferentie van het licht gereflecteerd en verstrooid door de biofilm (monsterarm) en het licht van de referentiearm wordt geanalyseerd. Een reeks axiale intensiteit profielen (A-scans) die diepte-opgeloste structurele informatie bevat wordt verworven en samengevoegd in een B-scan (een dwarsdoorsnede). Een reeks van aangrenzende B-scans componeert de laatste 3D volume scan¹⁰. Oct biedt een laterale optische resolutie in het bereik van ongeveer 10 μm en is daarom goed geschikt om mesoscopische structurele differentiatie van biofilms^10,12te bestuderen. Voor een meer gedetailleerde beschrijving van OCT, refereer je naar Drexler en Fujimoto¹³en fercher en collega’s¹⁴. Hoewel het gezichtsveld van een enkele OCT XY-scan tot honderden vierkante micrometers reikt, kunnen grotere patronen niet worden gekwantificeerd door middel van OCT in één scan. Met betrekking tot biofilms in natuurlijke habitats zoals beekjes en rivieren, beperkt dit momenteel ons vermogen om biofilm morfogenese te beoordelen op schaal die overeenkomt met het fysieke en hydraulische sjabloon van de habitat.

Om deze ruimtelijke limieten te overtreffen en automatisch OCT-scans te verwerven, werd een spectrale-domein OCT-beeldvormings sonde op een 3-assige positioneringssysteem gemonteerd. De installatie maakt de overname van verschillende OCT-scans in een overlappend mozaïek patroon (tegel scan) mogelijk, het effectief bereiken van de tomografische beeldvorming van oppervlakten tot 100 cm². Bovendien maakt de hoge positioneringsnauwkeurigheid van dit systeem het mogelijk om de groei en ontwikkeling van biofilm functies op specifieke sites op een betrouwbare manier te monitoren tijdens lange termijn experimenten. Het systeem is modulair en afzonderlijke componenten(d.w.z. positionerings apparaat en OCT) van de installatie kunnen worden gebruikt als standalone oplossingen of flexibel gecombineerd. Figuur 1 geeft een overzicht van de hard-en softwareonderdelen van de installatie.

Het systeem werd getest met een in de handel verkrijgbare GRBL-gestuurde CNC-positionerings inrichting (tafel van materialen). De bedrijfs afstanden van dit specifieke positionerings platform zijn 600 × 840 × 140 mm, met een door de fabrikant aangegeven nauwkeurigheid van +/-0,05 mm en een programmeerbare resolutie van 0,005 mm. GRBL is een open-source (GPLv3 licentie), high-performance Motion Control voor CNC Apparaten. Daarom moet elke op GRBL gebaseerde (versie > 1,1) positionerings apparaat compatibel zijn met de hier gepresenteerde richtlijnen en softwarepakketten. Bovendien, de software kan worden aangepast aan andere stepmotor controllers met stap-DIR input type met enkele modificaties.

Het LGO-apparaat dat wordt gebruikt om de prestaties van het systeem (tabel met materialen) te beoordelen, beschikt over een lichtbron met een lage coherentie met een middengolf lengte van 930 nm (bandbreedte = 160 Nm) en instelbare lengte en intensiteit van de referentiearm. In het voorbeeld dat hier wordt gepresenteerd, werd ook een Onderdompelings adapter gebruikt voor het dippen van de LGO-sonde in stromend water (tabel met materialen). Het softwarepakket dat hier is ontwikkeld voor geautomatiseerde OCT-scan acquisitie, is kritisch afhankelijk van de SDK die samen met het specifieke LGO-systeem wordt geleverd, maar de LGO-systemen van dezelfde fabrikant met verschillende scan lenzen en centrale golflengten moeten gemakkelijk compatibel.

Het GRBL-apparaat wordt bestuurd door een webserver die op een single board computer is geïnstalleerd (Figuur 1). Hiermee wordt de afstandsbediening van het apparaat vanaf elke computer met een lokaal netwerk of internettoegang verleend. Het LGO-apparaat wordt bestuurd door een afzonderlijke computer, waardoor de werking van het LGO-systeem wordt afgezien van de geautomatiseerde experimentele installatie. Tot slot bevatten de softwarepakketten bibliotheken voor het synchroniseren van de LGO-sonde positionering en de LGO-scan verwerving (d.w.z. om automatisch 3D-beeldsets te verwerven in een mozaïek patroon of in een set gedefinieerde posities). Door de positie van de LGO-sonde in 3D effectief te definiëren, kan het brandpuntsvlak specifiek worden aangepast voor (regionale) sets scans. Met name op ongelijke oppervlakken kunnen verschillende brand vlakken (d.w.z. verschillende posities in z-richting) voor elke LGO-scan worden gespecificeerd.

Er is een set softwarepakketten ontwikkeld voor het verwerken van RAW OCT-scans (tabel 1). Navigatie van het positionerings apparaat, OCT-scan acquisitie en verwerking van gegevensset worden uitgevoerd met python-gecodeerde Jupyter-notebooks, die opmerkelijke flexibiliteit in de ontwikkeling en optimalisatie van de software mogelijk maken. Twee bewerkte en geannoeerde voorbeelden van dergelijke notebooks (respectievelijk voorbeeld verwerving en-verwerking) zijn beschikbaar vanaf https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git ze zijn bedoeld als startpunt voor aanpassing van de methode. Een Jupyter-notebook is een web browser gebaseerde toepassing die cellen met geannoleerde python-code bevatten. Elke stap is opgenomen in een cel van het notitieblok, die afzonderlijk kan worden uitgevoerd. Vanwege de verschillende lengte van het lichtpad door de scan lens (sferische aberratie)¹⁵, worden de RAW-scans van de LGO vervormd weergegeven (Figuur 2a). We ontwikkelden een algoritme om automatisch te corrigeren voor deze vervorming in verworven OCT-scans (opgenomen in imageprocessing. ipynb, aanvullend bestand 1). Bovendien, biofilm morfologie kan worden gevisualiseerd als een 2D hoogtekaart, zoals eerder werd gebruikt in membraansystemen¹⁶, en we illustreren hoe hoogte kaarten verkregen uit scans in een betegeling array kan worden gestikt.

Ten slotte wordt de functionaliteit van de beschreven laboratoriuminstallatie geïllustreerd met behulp van een Flume-experiment waarbij fototrofische stroom biofilm wordt blootgesteld aan een gradiënt van stromingssnelheid.