Ön montajlı plastik mikrofluidik cips içinde ınsan kök hücresi türeyen neurons compartmentalization

Not: Şekil 1a, B ana kanallar veya bölmeleri, kuyuları ve Mikrokanal konumları da dahil olmak üzere, önceden montajlı COC çip bir şematik gösterir. Bölümleşmiş çip, gıda boyama boyasının yalıtımına göre bir bölme içinde farklı fluidik mikroortamlar oluşturabilir (Şekil 1C). Önceden montajlı çok bölme yongası hazırlamak için protokol nag, et al., Bölüm 112verilir. 1. hSC-nöronlar için çok bölmeli çiplerin kaplama Not: Şekil 2a kaplama prosedürlerine genel bir bakış gösterir. 20 μg/mL çalışma çözeltisi çip başına 600 μL çözüm yapmak için hücre kültürü sınıfı distile suda Poly-L-ornitin çözülür. Fişleri kuyulardan hazırladıktan sonra kalan PB ‘lerden sol aspirate. Aspirasyon yapılırken, pipet ucunun kanal açından uzak olduğundan emin olun.Not: mikrofluidik kanallar bu yordamın tamamı için doldurulmalıdır. Kanallar/bölmeler, sadece kuyular sıvı Aspire etmeyin. Yük 150 μL Poly-L-ornitin çalışma çözeltisi sağ üst iyi. 90 s veya sıvı kadar sağ alt doğru doldurmaya başlar bekleyin. Sağ alt sağa iyi 150 μL medya ekleyin ve sıvı mikrokanalların geçmesine izin vermek için 5 dakika bekleyin. 150 μL medya sol üst iyi ekleyin. Bekleyin 90 s ve sonra 150 μL sol alt iyi ekleyin. Çip (s) tutucusunu Parafilm ve yer ile 4 °C ‘ de bir gecede sarın.Not: Alternatif olarak, çip ve tutucuyu 37 °C ‘ de 1 saat boyunca yerleştirin. Pipet ucunun kanal açından uzağa yerleştirilmesini sağlayarak medyayı kuyulardan aspirate. 150 μL ‘ye, sağ üstteki steril su ekleyin. 90 s bekleyin ve sonra 150 μL sağ aşağı iyi ekleyin. Sıvı microgrooves geçmesine izin vermek için 5 dakika bekleyin. Sol üst iyi, 90 s bekleyin ve sonra başka bir 150 μL sol alt iyi ekleyin 150 μL steril su ekleyin. 1,5-1.6 arasındaki adımları yineleyin. Laminin yavaşça 2 °C ila 8 °C ‘ de çözülmesi ve 10 μg/mL çalışma çözeltisi hazırlamak. Yük 150 μL laminin çalışma çözeltisi sağ üst iyi. 90 s veya sıvı kadar sağ alt doğru doldurmaya başlar bekleyin. Pipet 150 μL sağ aşağı iyi. Laminin mikrokanalların içinden geçmesine izin vermek için 5 dakika bekleyin. 150 Ekle μL laminin sol üst iyi. Bekleyin 90 s ve sonra 150 μL sol alt iyi ekleyin. 37 °C ‘ de 2 saat için çipin tutucusunu inkulat. Yongası PBS ile durulayın (CA2 + ve mg2 +olmadan). Yük 150 μL PBS sağ üst iyi. 90 s veya sıvı kadar sağ alt doğru doldurmaya başlar bekleyin. Sağ alt doğru iyi PBS 150 μL ekleyin ve PBS Mikrokanal geçmesi izin vermek için 5 dakika bekleyin. Pipet 150 μL PBS sol üst iyi. Sonra 90 s pipet 150 μL sol alt iyi. Yongadan PBS aspirate ve sonra NSC medya ile çip durulayın (bkz. malzeme tablosu). Yük 150 μL medya sağ üst iyi. 90 s veya sıvı sağ alt sağ kanala geçtiğinde sonra sağ alt iyi 150 μL ekleyin. Mikro kanallar üzerinden medya akışına izin vermek için 5 dakika bekleyin. Sol üst iyi ve başka bir 150 μL sol alt iyi için medya 150 μL ekleyin. Chip ‘i, NSCs ‘ye hazır olana kadar ön koşul için 5% CO2 Ile 37 °c ‘ lik bir kuluçta olarak inkübe etmek.Not: cips gerekirse bir gecede önceden Klima olabilir. 2. NSCs ‘leri multicompartment yongasına diktir Not: Bu protokol, ticari olarak satın alınan NSCs kullanılır, önceki yayınımızın aksine insan embriyonik hücrelerle başlayan hücreler5. Bu protokol nöron kök hücreleri doğrudan plastik yongaları içine kaplamaları nerede nöronlar ayırt. Hücreler, 2 geçiş için NSCs (farklılaşma olmaksızın) olarak proliferasyon ve daha fazla kullanım için sıvı N2 ‘ de şişeler içinde depolanmasına izin verebilir. Bu protokol, 1 veya 2 geçişinden sonra sıvı N2 ‘ de saklanan NSC şişeleri kullanır. Şekil 2B kaplama prosedürlerine genel bir bakış gösterir. Üreticinin talimatlarına göre NSCs çözüyor.Not: Bu yordam H9 türetilen NSCs için geçerlidir. Diğer hücre hatları, hücre yoğunluğu optimizasyonu gerektirir. Bir hemokytometer kullanarak hücre konsantrasyonunu saymak ve mL başına 7 x 106 hücre konsantrasyonu elde etmek için NSC medya kullanarak ayarlayın. Çip her kuyunda medya aspirate. Ana kanallardan kaçının medya duman çekiş. Hücre çözeltisi pipet 5 μL sağ üst iyi, ardından 5 μL sağ alt iyi (70.000 hücreleri toplam). Hücrelerin ana kanal açılımlarına doğru pipetleme yapılacağını emin olun. Hücrelerin kanala girdiğini kontrol etmek için mikroskop kullanın. Hücreleri Chip altına uymak için 5 dk bekleyin.Not: hücreleri yüklemek için ya da her iki bölmeler kullanılabilir. Pipet ~ 150 μL NSC medyası sağ üst ve sonra 150 μL sağ alt iyi. Sol tarafta tekrar edin. Uygun bir nemlendirilmiş konteynır içinde% 5 CO2, 37 °c ‘ de Inküye yapın. 48 saat sonra, kuyulardan NSC medya Aspire ve her üst iyi ve her alt iyi 150 μL ekleyerek nöral farklılaşma medya ile değiştirin. % 5 CO2, 37 ° c ‘de kültür nöronlar uygun bir nemlendirici konteyner içinde kuluçta.Not: medya her 2-3 gün değiştirilmesi gerekir. Çipte kullanılan küçük hacimler nedeniyle, nemlendirilmiş bir kuluçsa içinde bile buharlaşma büyük ölçüde hücre viability etkileyebilir. Yonga ile hücrelerin uzun vadeli kültürü için ek nem sağlamak için uygun bir ikincil konteyner kullanın (bkz. malzeme tablosu). 3. çip içinde hSC-nöronların viral floresan etiketleme Not: birden fazla virüs çip içinde nöronlar etiket için kullanılabilir. Aşağıdaki talimatlar G-Deleted Rabies-mCherry veya – eGFP virüsü kullanımını tarif eder. Potansiyel olarak bulaşıcı maddeler uygulanabilir kurallar ve düzenlemelere göre ele alınmalıdır ve ek eğitim ve kurumsal onay gerektirebilir. Sıcak ~ 400 μL, çip başına 37 °C ‘ ye kadar taze nöral farklılaşma medyası. 50 μL medyaya bir iyi Axon bölmesinin bir santrifüjle tüp içine çıkarın ve sonra tüp değiştirilmiş kuduz virüsü 100.000 viral birimleri ekleyin.Not: düzgün harcanan pipet ipuçları ve virüs içeren santrifüj tüpler atın. Kalan nöral farklılaşma ortamını aksonal bölmesinden çıkarın ve santrifüj tüpüne yerleştirin. 37 °C ‘ de saklayın.Not: kanallar sıvı ile dolu kalır emin olun. 50 μL virüsü çözeltisi ile 150 μL ısıtılmış medyaya karıştırın. Pipet 100 μL ‘nin bir iyi aksiyon bölmesine ve 100 μL ‘ye de diğer Akon bölmesine doğru. 37 °C ‘ lik inküvatör içinde 2 saat boyunca kuluçat.Not: akal ve somatik bölmeler arasındaki hacimlerdeki fark, virüsün enfeksiyon/kuluçka süreleri sırasında aksal bölmede kalmasını sağlar. Virüs içeren medyayı çekin ve imha edin.DIKKAT: kapalı mikrofluidik kanallar içinde sıvı çıkarmayın. Yavaşça pipet 75 μL taze medya bir Axon bölmesine iyi ve medya diğer Akon iyi içine kanal akışı sağlar. Aksiyon bölmesinden medyayı çıkarın ve düzgün bir şekilde atın. 3,6 ve 3,7 adımları yineleyin. Axon bölmesini kaydedilmiş medyadan doldurun. Pipet bir ek 50 μL taze medya, gerekirse, ve sonra çipli için çip geri dönün. Bu ek taze medya işlem sırasında sıvı transferi ve buharlaşma sırasında medya kaybına doğru saymak etmektir.Not: Bu değiştirilmiş kuduz virüsleri kullanarak görünür floresan etiketleme 48 h tarafından oluşur ve en fazla 8 gün sonra virüslü nöronların hücre ölümü genellikle virüs toksisitesi nedeniyle oluşur. Nöron görüntüleme diğer standart kültür platformları (örn. cam alt yemekleri) ile yapılabilir, ancak evaporatif kayıpları önlemek için yeterli nemi korumak için özel bir dikkat gereklidir. 4. yonga içinde fluidik izolasyon, akotomi ve immünostasyon Fluidik izolasyon, akotomi, ve falı ile immünostasyon takip nag, ve al.12açıklandığı gibi.