組み立て済みプラスチックマイクロ流体チップ内のヒト幹細胞由来ニューロンの区分化

注:図1A、Bは、メインチャンネルまたはコンパートメント、井戸、およびマイクログルーブの位置を含む、組み立て済みのCOCチップの概略図を示しています。コンパートメント化されたチップは、食品着色剤の分離によって示すように、コンパートメント内に異なる流体微小環境を確立することができます(図1C)。組み立て済みのマルチコンパートメントチップを準備するためのプロトコルは、Nagendranら、セクション112で与えられています。 1. hSCニューロン用マルチコンパートメントチップのコーティング 注:図2Aは、コーティング手順の概要を示しています。 細胞培養性蒸留水にポリL-オルニチンを溶解し、20 μg/mL作動液のチップあたり600μLの溶液を作ります。 井戸からチップを準備した後、残りのPBSを吸引します。吸引するときは、ピペットの先端がチャネルの開口部から離れていることを確認します。注:マイクロ流体チャネルは、この手順全体を充填したままにする必要があります。チャネル/コンパートメントから液体を吸引しないでください, 唯一の井戸. 右上ウェルにポリL-オルニチン作動液を150μL積み込みます。90 sを待つか、液体が右下をよく満たし始めるまで待ちます。150 μL のメディアを右下によく追加し、液体がマイクロ溝を通過するまで 5 分間待ちます。 150 μL のメディアを左上によく追加します。90 s を待ってから、左下によく 150 μL を追加します。チップのホルダーをパラフィルムで包み、一晩4°Cに置きます。注:または、チップとホルダーを37°Cに1時間置きます。 井戸からメディアを吸引し、ピペットの先端がチャネルの開口部から離れていることを確認します。右上によく無菌水の150 μLを追加します。90 s を待ってから、右下によく 150 μL を追加します。液体がマイクロ溝を通過するまで5分間待ちます。 左上の井戸に150 μLの滅菌水を加え、90sを待ってから、左下の井戸にさらに150 μLを加えます。 手順 1.5-1.6 を繰り返します。 ラミニンを2°C~8°Cでゆっくりと解凍し、10μg/mLの作動液を調作する。 ラミニン加工液の150μLを右上によく積み込みます。90 sを待つか、液体が右下をよく満たし始めるまで待ちます。ピペは右下に150 μL。ラミニンがマイクロ溝を通過するのを5分間待ちます。 左上によく150 μLのラミニンを加えます。90 s を待ってから、左下によく 150 μL を追加します。チップをホルダー内で2時間37°Cでインキュベートします。 PBSでチップをすすいで(Ca2+と Mg2+なし)。PBSの150 μLを右上によく積み込みます。90 sを待つか、液体が右下をよく満たし始めるまで待ちます。右下に150 μLのPBSを追加し、PBSがマイクロ溝を通過させるのを5分間待ちます。 PBSのピペは左上によくピペ。90sピペの後150 μLを左下によく。 チップからPBSを吸引し、NSCメディアでチップをすすいでください(材料の表を参照)。150 μL のメディアを右上に十分にロードします。90 s の後、または液体が右下の井戸に右チャネルを通過するときは、右下ウェルに 150 μL を追加します。メディアがマイクロ溝を流れるまで5分間待ちます。 左上に150μLのメディアを追加し、左下ウェルに150 μLを追加します。5%CO2でチップを37°Cインキュベーターでインキュベートし、NSCの種子が出来上がるまでチップを予め調整します。注:チップは、必要に応じて一晩事前に条件付けすることができます。 2. NSCをマルチコンパートメントチップにシードする 注:このプロトコルは、ヒト胚性幹細胞5で始まった我々の以前の出版物とは異なり、商業的に購入されたNSCを使用しました。このプロトコルでは、神経幹細胞は、ニューロンに分化するプラスチックチップに直接めっきされます。細胞は、最大2つの通路のためのNSC(分化なし)として増殖させることができ、さらに使用するために液体N2のバイアルに貯蔵することができる。このプロトコルは、通路1または2の後に液体N2に格納されたNSCバイアルを使用する。図2Bは、コーティング手順の概要を示す。 製造元の指示に従って NSC を解凍します。注: この手順は、H9 由来の NSC に適用されます。他のセルラインでは、細胞密度の最適化が必要になります。 ヘモサイトメーターを使用して細胞濃度をカウントし、NSC培媒を使用して調整して、mLあたり7 x 106細胞の濃度を得る。 チップの各井戸からメディアを吸引します。メイン チャンネルからメディアを吸引しないようにします。 ピペト5μLの細胞溶液を右上ウェルに、続いて右下ウェルに5μL(合計70,000細胞)を続ける。セルがメイン チャネルの開口部に向かってピペットされていることを確認します。顕微鏡を使用して、細胞がチャネルに入っていることを確認します。細胞がチップの底に付着するのを5分間待ちます。注: セルの読み込みには、どちらか一方または両方のコンパートメントを使用できます。 右上にNSC培媒のピペット~150 μL、右下ウェルに150μL。左側で繰り返します。5%CO 2、37°Cで適切な加湿容器内でインキュベートします。 48時間後、ウェルからNSC培メディアを吸引し、各トップウェルと各底部に150μLを加えることで神経分化培ったメディアに置き換えます。 5%CO2、37°Cインキュベーター内の培養ニューロンは、適切な加湿容器内で。注: メディアは 2 ~ 3 日ごとに交換する必要があります。チップに使用される少量のため、加湿インキュベーター内でも蒸発が細胞の生存率に大きな影響を与える可能性があります。適切な二次容器を使用して、チップを使用した細胞の長期培養に追加の湿度を提供します(材料の表を参照)。 3. チップ内のhSC-ニューロンのウイルス蛍光標識 注:複数のウイルスを使用して、チップ内のニューロンにラベルを付けることができます。以下の手順では、G-削除された狂犬病-mCherryまたは -eGFPウイルスの使用について説明します。感染の可能性のある材料は、適用される規則や規則に従って取り扱う必要があり、追加のトレーニングと機関の承認が必要な場合があります。 チップ当たりの新鮮な神経分化媒体を37°Cに~400μL温めます。 軸ゾンコンパートメントの1つの井戸から50 μLのメディアを遠心管に取り出し、100,000のウイルスユニットの改変狂犬病ウイルスをチューブに追加します。注:使用済みのピペ状の先端とウイルスを含む遠心管を適切に廃棄します。 軸室から残りの神経分化媒体を取り外し、遠心管に入れます。37 °Cで保存します。注: チャネルが液体で満たされたままであることを確認します。 50 μL のウイルス溶液を 150 μL の温めた媒体と混合します。ピペは軸室の1つの井戸に100 μL、他の軸室に100 μLをウェルよく。37°Cのインキュベーター内で2時間インキュベートします。注:軸室と体性コンパートメントの間の体積の違いは、感染/インキュベーション時間中にウイルスが軸室にとどまることを保証するのに役立ちます。 ウイルスを含むメディアを撤回して廃棄する。注意:同封のマイクロ流体チャネル内の液体を除去しないでください。 新鮮なメディアの75 μLを1つの軸室に穏やかにピペットし、メディアがチャネルを通って他の軸にうまく流れ込みます。 アクソンコンパートメントからメディアを取り外し、適切に廃棄します。 手順 3.6 と 3.7 を繰り返します。 アクソンコンパートメントに保存されたメディアを入力します。必要に応じて、さらに50μLの新鮮なメディアをピプテし、チップをインキュベーターに戻します。この追加の新鮮な媒体は、プロセス中の液体移動および蒸発中の媒体の損失にカウントされる。注:これらの改変狂犬病ウイルスを用いた目に見える蛍光標識は、感染したニューロンの細胞死が一般的にウイルス毒性のために起こる48時間および8日後までに生じる。ニューロンイメージングは、他の標準的な培養プラットフォーム(例えば、ガラス底皿)と同様に行うことができますが、蒸発損失を防ぐために十分な湿度を維持するために特別な考慮が必要です。 4. チップ内の流体分離、軸切除、免疫染色 Nagendran et al.12.に記載されているように、チップを使用した流体単離、軸切除、および免疫染色に従ってください。