Ce protocole démontre l’utilisation de puces microfluidiques compartimentées, injection moulée dans un copolymère olefin cyclique aux neurones cultivés différenciés des cellules souches humaines. Ces puces sont préassemblées et plus faciles à utiliser que les dispositifs traditionnels compartimentés poly (diméthysiloxane). Plusieurs paradigmes expérimentaux communs sont décrits ici, y compris l’étiquetage viral, l’isolement fluidique, l’axotomie, et l’immunostaining.
L’utilisation d’appareils microfluidiques pour compartimenter les neurones cultivés est devenue une méthode standard en neurosciences. Ce protocole montre comment utiliser une puce multi-compartiment pré-assemblée fabriquée dans un copolymère olefin cyclique (COC) pour compartimenter les neurones différenciés des cellules souches humaines. L’empreinte de ces puces COC est la même qu’une lame de microscope standard et est également compatible avec la microscopie à haute résolution. Les neurones sont différenciés des cellules souches neurales humaines (NSC) en neurones glutamatergiques dans la puce et maintenus pendant 5 semaines, ce qui laisse suffisamment de temps pour ces neurones de développer des synapses et des épines dendritiques. En outre, nous démontrons de multiples procédures expérimentales communes utilisant ces puces multi-compartiment, y compris l’étiquetage viral, établissant des microenvironnements, l’axotomy, et l’immunocytochimie.
Les neurones différenciés par cellules souches humaines (hSC-neurones) sont de plus en plus utilisés pour la recherche biologique. Ces neurones, qui peuvent être dérivés de matériel de source humaine, sont d’un grand intérêt pour la recherche translationnelle, y compris l’étude des lésions cérébrales traumatiques et des troubles neurodégénératifs tels que la maladie d’Alzheimer. Ainsi, des outils pour améliorer et faciliter l’étude des hSC-neurones sont en demande.
Pour étudier la morphologie polarisée unique des neurones, de nombreux chercheurs utilisent des dispositifs microfluidiques multi-compartimentés1,2,3,4,5,6, 7,8,9,10,11. Ces dispositifs permettent des mesures et des manipulations de longs neurones de projection avec un accès sous-cellulaire unique. Les dispositifs microfluidiques multicompartimentisés se composent de deux compartiments microfluidiques parallèles séparés par des microgrooves, qui guident la croissance axonale. Les neurones ou les cellules souches neurales (CNS) sont plaqués dans le compartiment somatodendritic, puis adhèrent au fond de la surface du compartiment après quelques minutes. Les neurones différenciés se développent et étendent leurs axones/projections à travers la région de microgroove dans un compartiment axonal adjacent et isolé. Dans le passé, ces dispositifs étaient exclusivement fabriqués à l’aide de moulage poly (diméthylsiloxane) (PDMS). Les dispositifs PDMS ont de nombreux inconvénients précédemment décrits12, y compris l’hydrophobicité persistante et la nécessité d’assembler à un couvercle de verre immédiatement avant l’utilisation. Les puces moulées par injection pré-assemblées surmontent bon nombre de ces inconvénients et sont vendues commercialement (voir Tableau des matériaux)12. Les compartiments de ces puces sont rendus hydrophiles en permanence et la puce entière est moulée par injection en copolymère cyclique à nageoires optiques transparentes (COC).
Ce protocole démontre comment utiliser cette puce COC pour différencier les NSC humains en neurones excitatrices, et pour séparer et isoler fluidement leurs longues projections neuronales. Pour cette démonstration, les neurones ont été différenciés des cellules souches H9 approuvées par les NIH. Des procédures similaires peuvent être utilisées pour différencier les cellules souches pluripotentes induites par l’homme.
La puce COC multi-compartiments préassemblée est une plate-forme compartimentée facile à utiliser pour différencier et maintenir les NSC humains en neurones pendant une longue période(m. Dans ce protocole, nous démontrons la différenciation des NSC humains en neurones glutamatergiques, neurones rétrogrades d’étiquette, effectuons l’immunocytochimie, visualisons la morphologie dendritique de la colonne vertébrale et effectuons l’axotomie. Ces puces sont compatibles avec l’imagerie à haute résolution et il n’y a pas d’autofluorescence avec le COC12.
Les puces multi-compartiments COC sont fonctionnellement équivalentes aux dispositifs compartimentés à base de silicone, et ont des avantages et des inconvénients comme décrit précédemment12. Le tableau 1 compare les puces COC multi-compartiments et les dispositifs en silicone pour la culture des neurones hSC. Les copeaux compartimentés coC offrent une meilleure surface hydrophile pour l’attachement et l’entretien des cellules souches sur une longue période de culture. Les dispositifs à base de PDMS doivent être assemblés et fixés aux couvercles en verre. La nature hydrophobe des dispositifs PDMS provoquel’agrégation des cellules souches 5; ceci mène aux deux défis dans l’imagerie au niveau cellulaire et à une plus grande susceptibilité aux dommages physiques dus au mouvement des agrégats cellulaires pendant des changements de médias. La puce en plastique surmonte ces défis. Le COC est imperméable au gaz, contrairement au PDMS, de sorte que les poches d’air emprisonnées ou formées dans les canaux doivent être enlevées par l’utilisateur. La solution de pré-enrobage réduit la possibilité pour l’air de se coincer dans les canaux. Cette solution se compose d’éthanol et d’autres agents. Un protocole précédemment publié pour la culture des neurones murines dans ces puces en plastique fournit des détails supplémentaires sur les cellules pipetting et les médias dans les puces12. Les CNS sont plus fragiles que les neurones murins, donc doivent être manipulés plus doucement. Il est également essentiel de bien mélanger les cellules souches avant de les placage en les faisant doucement monter et descendre.
L’utilisation de neurones dérivés de cellules souches humaines différenciées in vitro est de plus en plus populaire en médecine et en recherche. Ces neurones sont importants pour la recherche et les applications cliniques pour de nombreux troubles du SNC, y compris les maladies neurodégénératives et les lésions cérébrales traumatiques. Ces neurones ressemblent étroitement aux neurones fœtaux humains15. À l’avenir, des neurones bien vieillis pourraient être générés à partir de cellules souches pour imiter la fonction neuronale liée à l’âge et utilisés en conjonction avec ces dispositifs compartimentés. Ces dispositifs faciliteront la recherche dans les maladies affectant la santé et la fonction d’axone telles que des déficits d’axone dans des neurones des patients diagnostiqués avec des désordres de spectre d’autisme et la régénération axonale après la blessure16,17.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs reconnaissent le soutien de Xona Microfluidics, LLC, le National Institute of Mental Health (R42 MH097377), et le National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R41 NS108895, P30 NS045892). Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health.
Alexa Fluor hydrazide 488 | ThermoFisher Scientific | A10436 | |
Alexa Fluor secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | 1:1000 | |
anti_beta-tubulin III | Aves | TUJ | 1:1000 |
anti-vGAT antibody | Synaptic Systems | 131 003 | 1:1000 |
anti-vGlut1 antibody | NeuroMab | 75-066 | clone N28/9, 1:100 |
complete neural stem cell media: | |||
REC HU EGF 10 UG BIOSOURCE (TM) |
ThermoFisher Scientific | PHG0314 | 20ng/mL |
REC HU FGF BASIC 10 UG BIOSOURCE (TM) |
ThermoFisher Scientific | PHG0024 | 20ng/mL |
GlutaMAX Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 35050061 | 2mM |
KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 12660012 | |
StemPro Neural Supplement | ThermoFisher Scientific | A1050801 | 2% |
Epifluorescence imaging system | EVOS Fluorescence imaging system | AMF4300 | 10x objective |
fluorinated ethylene propylene film | American Durafilm | 50A | 0.5 mil thickness |
Fluoromount G | ThermoFisher Scientific | 00-4958-02 | |
Gibco DPBS without Calcium and Magnesium | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
GIBCO HUMAN NSC (H9) KIT COMBO KIT |
Gibco | N7800200 | |
Gibco Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
Glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | CLS7095D5X SIGMA | 5.75 in length |
H9-DERIVED HU NEURAL STEM CELL 1E6 CELLS/VIAL; 1 ML |
ThermoFisher Scientific | 510088 | |
hibernate-E Medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
Incubator, 5% CO2 37 °C | |||
Laser scanning confocal imaging system | Olympus | FV3000RS | 30x silicone oil objective |
modified rabies virus | Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-eGFP | Material Transfer Agreement required |
Mr. Frosty | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | |
Neural differentiation media | Per 100 mL. | ||
Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher Scientific | 15240112 | 1mL (100X) |
Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A8960 | 200mM |
BDNF | ThermoFisher Scientific | PHC7074 | 40 ng/mL |
Gibco B27 Plus Supplement (50X) | FisherScientific | A3582801 | 2mL (50X) |
Gibco CultureOne Supplement (100X) | FisherScientific | A3320201 | 1mL (100X) |
Gibco Neurobasal Plus Medium | FisherScientific | A3582901 | |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher Scientific | A1110501 | |
Taylor Wharton Liquid N2 dewar | FisherScientific | 20HCB11M | |
triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 28314 | |
XC pre-coat | Xona Microfluidics, LLC | XC Pre-Coat | included with XonaChips |
XonaChip | Xona Microfluidics, LLC | XC450 | 450 µm length microgroove barrier |
Humidifier Tray | Xona Microfluidics, LLC | humidifier tray |