Summary

ניתוח עצבי הפנים במודל חולדה כדי ללמוד עיכוב Axonal והתחדשות

Published: May 05, 2020
doi:

Summary

פרוטוקול זה מתאר גישה מגובשת לניתוח עצבי הפנים במודל החולדה, כולל תיאורים של דפוסים inducible שונים של פציעה.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר שיטות עקביות ומתחדשות כדי ללמוד להתחדשות האקאליות ועכבות במודל של פגיעה בעצב הפנים חולדה. עצב הפנים יכול להיות מניפולציות לאורך כל אורכו, מפלח התוך-גולגולתי שלה אל המסלול החיצוני שלה. ישנם שלושה סוגים עיקריים של פגיעה בעצב המשמש למחקר ניסיוני של מאפייני רגנרציה: התאהבות עצבים, transection, ופער העצבים. מגוון התערבויות אפשריות הוא עצום, כולל מניפולציה כירורגית של העצב, משלוח של ריאגנטים נוירואקטיבי או תאים, או מניפולציות מרכזי או איברים הקצה. היתרונות של מודל זה ללימוד התחדשות עצבים כוללים פשטות, התמדה, עקביות בין מינים, שיעורי הישרדות אמין של החולדה, ו בגודל אנטומי מוגבר ביחס מודלים murine. המגבלות שלה כרוכות מניפולציה גנטית מוגבלת יותר לעומת מודל העכבר ואת יכולת ההתחדשות של החולדה, כגון מדען עצבי הפנים חייב להעריך נקודות זמן להתאוששות ואם לתרגם את התוצאות לבעלי חיים גבוהים יותר ולימודי אדם. מודל החולדה לפגיעה בעצב הפנים מאפשר פונקציונליות, אלקטרופיסיולוגית, ופרמטרים היקמריים לפרשנות והשוואה של התחדשות העצב. הדבר מתגאה בפוטנציאל עצום לקידום ההבנה והטיפול בהשלכות ההרסניות של פגיעה בעצב הפנים בחולים אנושיים.

Introduction

פגיעה בעצב הגולגולת בראש ובצוואר יכול להיות משני כדי מולדות, זיהומיות, אידיופטית, iatrogenic, טראומטי, נוירולוגי, אונולוג’יק, או חבלות מערכתית1. עצב הגולגולת השביעי, או עצב הפנים, מושפע בדרך כלל. השכיחות של תפקוד עצבי הפנים יכול להיות משמעותי, כפי שהוא משפיע על 20 כדי 30 לכל 100,000 אנשים בכל שנה2. ענפי המנוע העיקריים של עצב הפנים הם הזמן, הנזיזים, הלסת התחתונה, שוליים וענפים בצוואר הרחם; בהתאם לענף מעורב, ההשלכות יכולות לכלול יכולת למניעת הדלקת ריר אוראלי, יובש הקרנית, חסימה בשדה ויזואלי משני כדי ptosis לדיסאראז, או הפנים א-סימטרי2,3. תחלואה ארוכת טווח כוללת תופעה של synkinesis, או תנועה בלתי רצונית של קבוצה אחת של שריר הפנים, עם ניסיון התכווצות מרצון של קבוצת שריר הפנים ברורים. הsynkinesis אוראלית-אוראלי הוא הנפוץ ביותר של התחדשות חריגה כמו הסקוויה של פגיעה בעצב הפנים וגורם ליקוי פונקציונלי, מבוכה, הערכה עצמית פחתה, ואיכות העניים של החיים3. פגיעה בענפים בודדים מכתיבה את הפונקציות הנמצאות בסיכון סלקטיבי.

הטיפול הקליני של פציעה בעצב הפנים אינו מתוקננת היטב והוא זקוק למחקר נוסף כדי לשפר את התוצאות. סטרואידים יכולים להקל על נפיחות בעצב הפנים חריפה, בעוד בוטוקס הוא שימושי עבור התנועות התחביטיים בתנועה; אבל, האפשרויות השיחזור העיקריות בארמנטריום של המטפל כרוכות בהתערבות כירורגית באמצעות תיקון עצבי, החלפה או הנפשה מחודשת3,4,5,6. בהתאם לסוג של פגיעה בעצב הפנים מתמשכת, מנתח עצבי הפנים עשוי לנצל מספר אפשרויות. עבור transection פשוט, החיבור העצבי הוא שימושי בעוד תיקון השתל כבל מתאים יותר לפגם עצבי; עבור שחזור של פונקציה, המנתח יכול לבחור את הליכים סטטי או דינמי הפנים מחדש. במקרים רבים של פגיעה בעצב הפנים ותיקון הבאים, גם בידי מנתחים מנוסים עצב הפנים, התוצאה הטובה ביותר עדיין התוצאות של אי-סימטריה הפנים מתמשך פשרה תפקודית7.

התוצאות האופטימליות הללו דרזו מחקר נרחב על התחדשות עצבי הפנים. נושאים נרחבים של הריבית כוללים לשכלול וחדשנות טכניקות תיקון עצבי, קביעת ההשפעה של גורמים שונים התחדשות העצבים, ולהעריך את הפוטנציאל של מעכבי עצביים ספציפיים כדי לעזור להילחם את התוצאה לטווח ארוך של synkinesis8,9,10,11. בעוד מודלים בתחום החוץ ניתן להשתמש כדי להעריך מאפיינים מסוימים של הפרו-צמיחה או מעכבות, מחקר הטרנסלtional אמיתי על נושא זה הוא הטוב ביותר באמצעות מודלים בעלי חיים לתרגום.

ההחלטה של איזה מודל בעלי חיים לנצל יכול להיות מאתגר, כמו חוקרים השתמשו הן בעלי חיים גדולים, כגון כבשים ומודלים בעלי חיים קטנים, כגון עכברים12,13. בעוד דגמי בעלי חיים גדולים מציעים הדמיה אנאטומית אידיאלית, השימוש בהם מצריך ציוד מיוחד ואנשי צוות לא בקלות או זמין. יתר על כן, הפעלת מחקר כדי להפגין אפקט יכול להיות מאוד חסכוני ובלתי אפשרי בתוך הטווח הריאלי של מרכזים מדעיים רבים. לפיכך, המודל החי הקטן מנוצל לעתים קרובות. מודל העכבר יכול להיות מנוצל להערכת מספר תוצאות הקשורות לניתוח עצבי הפנים; עם זאת, אורך מוגבל של העצב יכול להגביל את יכולתו של המדען לדגמן דפוסים מסוימים, כגון פגיעה בפער גדול14.

כך, אב טיפוס חולדה murine התפתחה בתור מודל סוס עבודה שדרכו המדען יכול לבצע הליכים כירורגיים חדשניים או לנצל מעכבות או פרו-צמיחה גורמים ולהעריך את האפקט על פני מגוון רחב של פרמטרים התוצאה. האנטומיה של עצב הפנים של החולדה היא בדרך-כצפוי ובקלות מתקרב באופן שאינו ניתן לעיצוב. בקנה מידה גדול יותר, בהשוואה למודל העכבר, מאפשר מידול של מגוון רחב של פגמים כירורגיים, החל רוחבי פשוטה 5 מ”מ פערים15,16. זה עוד מאפשר את היישום של התערבויות מורכבות באתר פגם, כולל מיקום אקטואלי של פקטור, intraneural זריקות של פקטור, ואת המיקום של איזושתלים או גשרים17,18,19,20,21,22,23.

האופי הצייתן של העכברוש, האנטומיה האמינה שלה, ואת הנטייה שלה להתחדשות העצב יעיל מאפשר את האוסף של צעדים רבים התוצאות בתגובה לדפוסי ניתוח כאמור של פציעה24. דרך המודל חולדה, מדען עצבי הפנים הוא מסוגל להעריך את התגובות אלקטרופיזיולוגיות לפציעה, עצב ושריר היסטולוגיים התוצאות באמצעות אימונוהיסטוכימיה, תוצאות פונקציונליות דרך מעקב אחר התנועה של הלוח vibrissal והערכת סגירת העין, ו מיקרו-ומקרוסקופי שינויים באמצעות פלורסנט או קונפוקלית מיקרוסקופ, בין השאר11,22,23,25,26,27,28,29 לפיכך, הפרוטוקול הבא מתווה גישה כירורגית לעצב הפנים של החולדה ולדפוסי הפציעה שיכולים להיגרם.

Protocol

כל התערבויות בוצעו בהתאמה קפדנית עם הנחיות המכון הלאומי לבריאות (NIH). הפרוטוקול הניסיוני אושר על ידי המועצה לטיפול בעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת מישיגן & השימוש הוועדה (IACUC) לפני היישום. מבוגרת בת 10 שבועות. שהיו משתמשים בחולדות 1. לפני היום הפעיל להבטיח מלאי המתאים של כ?…

Representative Results

לאחר הליך הניתוח הראשוני, ישנם שני סוגים עיקריים של מדדי התוצאה: מדידות סדרתיות בעלי חיים ומדידות הדורשות הקרבת החיה. דוגמאות של מדידות טוריות כוללות אלקטרופיזיולוגיה assays כגון פעולה שרירים מורכבים המדד הפוטנציאלי30, הערכות של תנועת שריר הפנים דרך באמצעות לי…

Discussion

מודל פציעה הפנים חולדה הגוף התפתחה כמערכת המגוונת ביותר עבור הערכה של גורמים neurotrophic בשל נגישות כירורגית שלה, מסעף דפוס, ומשמעות פיזיולוגית27,29,33,34,35,36. השילוב של הדגמת וידאו ויישום ש…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

S.A.A. ממומנת על ידי האקדמיה האמריקנית לפלסטיקה הפנים וניתוח שיחזור לזלי ברנשטיין תוכנית מענקים.

Materials

1.8% isoflurane VetOne 13985-030-40
11-0 nylon microsutures AROSuture TK-117038
4-0 monocryl suture VWR 75982-084
Buprenorphine SR ZooPharm MIF 900-006
Carprofen Sigma-Aldrich MFCD00079028
Chlorhexidine VWR IC19135805
Jeweler forceps VWR 21909-458
Micro Weitlaner retractor VWR 82030-146
Micro-scissors VWR 100492-348
Mini tenotomy scissors VWR 89023-522
Number 15 scalpel blade VWR 102097-834
Operating microscope Leica
Petrolatum eye gel Pharmaderm B002LUWBEK
Sterile water VWR 89125-834
Tissue adhesive Vetbond, 3M NC9259532
Water conductor pad Aqua Relief System ARS2000B

References

  1. Chan, J. Y. K., Byrne, P. J. Management of facial paralysis in the 21st century. Facial Plastic Surgery. 27 (4), 346-357 (2011).
  2. Razfar, A., Lee, M. K., Massry, G. G., Azizzadeh, B. Facial Paralysis Reconstruction. Otolaryngologic Clinics of North America. 49 (2), 459-473 (2016).
  3. Couch, S. M., Chundury, R. V., Holds, J. B. Subjective and objective outcome measures in the treatment of facial nerve synkinesis with onabotulinumtoxinA (Botox). Ophthalmic Plastic and Reconstructive Surgery. 30 (3), 246-250 (2014).
  4. Wei, L. A., Diels, J., Lucarelli, M. J. Treating buccinator with botulinum toxin in patients with facial synkinesis: A previously overlooked target. Ophthalmic Plastic and Reconstructive Surgery. 32 (2), 138-141 (2016).
  5. Cooper, L., Lui, M., Nduka, C. Botulinum toxin treatment for facial palsy: A review. Journal of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery. 70 (6), 833-841 (2017).
  6. Choi, K. H., et al. Botulinum toxin injection of both sides of the face to treat post-paralytic facial synkinesis. Journal of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery. 66 (8), 1058-1063 (2013).
  7. Yang, X. N., et al. Peripheral nerve repair with epimysium conduit. Biomaterials. 34 (22), 5606-5616 (2013).
  8. Banks, C. A., et al. Long-term functional recovery after facial nerve transection and repair in the rat. Journal of Reconstructive Microsurgery. 31 (3), 210-216 (2015).
  9. Hadlock, T. A., Kowaleski, J., Lo, D., MacKinnon, S. E., Heaton, J. T. Rodent facial nerve recovery after selected lesions and repair techniques. Plastic and Reconstructive Surgery. 125 (1), 99-109 (2010).
  10. Hadlock, T., et al. The effect of electrical and mechanical stimulation on the regenerating rodent facial nerve. Laryngoscope. 120 (6), 1094-1102 (2009).
  11. Hadlock, T., et al. Functional assessments of the rodent facial nerve: A synkinesis model. Laryngoscope. 118 (10), 1744-1749 (2008).
  12. Diogo, C. C., et al. The use of sheep as a model for studying peripheral nerve regeneration following nerve injury: review of the literature. Neurological Research. 39 (10), 926-939 (2017).
  13. Wanner, R., et al. Functional and Molecular Characterization of a Novel Traumatic Peripheral Nerve–Muscle Injury Model. NeuroMolecular Medicine. 19 (2-3), 357-374 (2017).
  14. Olmstead, D. N., et al. Facial nerve axotomy in mice: A model to study motoneuron response to injury. Journal of Visualized Experiments. (96), e52382 (2015).
  15. Maeda, T., Hori, S., Sasaki, S., Maruo, S. Effects of tension at the site of coaptation on recovery of sciatic nerve function after neurorrhaphy: Evaluation by walking-track measurement, electrophysiology, histomorphometry, and electron probe X-ray microanalysis. Microsurgery. 19 (4), 200-207 (1999).
  16. Zhang, F., Inserra, M., Richards, L., Terris, D. J., Lineaweaver, W. C. Quantification of nerve tension after nerve repair: Correlations with nerve defects and nerve regeneration. Journal of Reconstructive Microsurgery. 17 (6), 445-451 (2001).
  17. Macfarlane, B. V., Wright, A., Benson, H. A. E. Reversible blockade of retrograde axonal transport in the rat sciatic nerve by vincristine. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 49 (1), 97-101 (1997).
  18. Stromberg, B. V., Vlastou, C., Earle, A. S. Effect of nerve graft polarity on nerve regeneration and function. Journal of Hand Surgery. 4 (5), 444-445 (1979).
  19. Sotereanos, D. G., et al. Reversing nerve-graft polarity in a rat model: The effect on function. Journal of Reconstructive Microsurgery. 8 (4), 303-307 (1992).
  20. Whitlock, E. L., et al. Ropivacaine-induced peripheral nerve injection injury in the rodent model. Anesthesia and Analgesia. 111 (1), 214-220 (2010).
  21. Lloyd, B. M., et al. Use of motor nerve material in peripheral nerve repair with conduits. Microsurgery. 27 (2), 138-145 (2007).
  22. Kawamura, D. H., et al. Regeneration through nerve isografts is independent of nerve geometry. Journal of Reconstructive Microsurgery. 21 (4), 243-249 (2005).
  23. Brenner, M. J., et al. Repair of motor nerve gaps with sensory nerve inhibits regeneration in rats. Laryngoscope. 116 (9), 1685-1692 (2006).
  24. Brenner, M. J., et al. Role of timing in assessment of nerve regeneration. Microsurgery. 28 (4), 265-272 (2008).
  25. Heaton, J. T., et al. A system for studying facial nerve function in rats through simultaneous bilateral monitoring of eyelid and whisker movements. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 197-206 (2008).
  26. Magill, C. K., Moore, A. M., Borschel, G. H., Mackinnon, S. E. A new model for facial nerve research: The novel transgenic Thy1-GFP rat. Archives of Facial Plastic Surgery. 12 (5), 315-320 (2010).
  27. Guntinas-Lichius, O., et al. Factors limiting motor recovery after facial nerve transection in the rat: Combined structural and functional analyses. European Journal of Neuroscience. 21 (2), 391-402 (2005).
  28. Skouras, E., et al. Manual stimulation, but not acute electrical stimulation prior to reconstructive surgery, improves functional recovery after facial nerve injury in rats. Restorative Neurology and Neuroscience. 27 (3), 237-251 (2009).
  29. Bischoff, A., et al. Manual stimulation of the orbicularis oculi muscle improves eyelid closure after facial nerve injury in adult rats. Muscle and Nerve. 39 (2), 197-205 (2009).
  30. Schulz, A., Walther, C., Morrison, H., Bauer, R. In vivo electrophysiological measurements on mouse sciatic nerves. Journal of Visualized Experiments. (86), e51181 (2014).
  31. Placheta, E., et al. Macroscopic in vivo imaging of facial nerve regeneration in Thy1-GFP rats. JAMA Facial Plastic Surgery. 17 (1), 8-15 (2015).
  32. Moore, A. M., et al. A transgenic rat expressing green fluorescent protein (GFP) in peripheral nerves provides a new hindlimb model for the study of nerve injury and regeneration. Journal of Neuroscience Methods. 204 (1), 19-27 (2012).
  33. Grosheva, M., et al. Early and continued manual stimulation is required for long-term recovery after facial nerve injury. Muscle and Nerve. 57 (1), 100-106 (2018).
  34. Grosheva, M., et al. Comparison of trophic factors’ expression between paralyzed and recovering muscles after facial nerve injury. A quantitative analysis in time course. Experimental Neurology. 279, 137-148 (2016).
  35. Grosheva, M., et al. Local stabilization of microtubule assembly improves recovery of facial nerve function after repair. Experimental Neurology. 209 (1), 131-144 (2008).
  36. Angelov, D. N., et al. Mechanical stimulation of paralyzed vibrissal muscles following facial nerve injury in adult rat promotes full recovery of whisking. Neurobiology of Disease. 26 (1), 229-242 (2007).
  37. Tomov, T. L., et al. An example of neural plasticity evoked by putative behavioral demand and early use of vibrissal hairs after facial nerve transection. Experimental Neurology. 178 (2), 207-218 (2002).
  38. Streppel, M., et al. Focal application of neutralizing antibodies to soluble neurotrophic factors reduces collateral axonal branching after peripheral nerve lesion. European Journal of Neuroscience. 15 (8), 1327-1342 (2002).
  39. Peeva, G. P., et al. Improved outcome of facial nerve repair in rats is associated with enhanced regenerative response of motoneurons and augmented neocortical plasticity. European Journal of Neuroscience. 24 (8), 2152-2162 (2006).
  40. Pavlov, S. P., et al. Manually-stimulated recovery of motor function after facial nerve injury requires intact sensory input. Experimental Neurology. 211 (1), 292-300 (2008).
  41. Guntinas-Lichius, O., et al. Transplantation of olfactory ensheathing cells stimulates the collateral sprouting from axotomized adult rat facial motoneurons. Experimental Neurology. 172 (1), 70-80 (2001).
  42. Guntinas-Lichius, O., Angelov, D. N., Stennert, E., Neiss, W. F. Delayed hypoglossal-facial nerve suture after predegeneration of the peripheral facial nerve stump improves the innervation of mimetic musculature by hypoglossal motoneurons. Journal of Comparative Neurology. 387 (2), 234-242 (1997).
  43. Sinis, N., et al. Electrical stimulation of paralyzed vibrissal muscles reduces endplate reinnervation and does not promote motor recovery after facial nerve repair in rats. Annals of Anatomy. 191 (4), 356-370 (2009).
  44. Kiryakova, S., et al. Recovery of whisking function promoted by manual stimulation of the vibrissal muscles after facial nerve injury requires insulin-like growth factor 1 (IGF-1). Experimental Neurology. 222 (2), 226-234 (2010).
  45. Banati, R. B., et al. Early and rapid de novo synthesis of Alzheimer βA4-Amyloid precursor protein (APP) in activated microglia. Glia. 9 (3), 199-210 (1993).
  46. Blinzinger, K., Kreutzberg, G. Displacement of synaptic terminals from regenerating motoneurons by microglial cells. Zeitschrift für Zellforschung und Mikroskopische Anatomie. 85 (2), 145-157 (1968).
  47. Rieske, E., et al. Microglia and microglia-derived brain macrophages in culture: generation from axotomized rat facial nuclei, identification and characterization in vitro. Brain Research. 492 (1-2), 1-14 (1989).
  48. Matsumoto, K., et al. Peripheral nerve regeneration across an 80-mm gap bridged by a polyglycolic acid (PGA)-collagen tube filled with laminin-coated collagen fibers: A histological and electrophysiological evaluation of regenerated nerves. Brain Research. 868 (2), 315-328 (2000).
  49. Mattsson, P., Janson, A. M., Aldskogius, H., Svensson, M. Nimodipine promotes regeneration and functional recovery after intracranial facial nerve crush. Journal of Comparative Neurology. 437 (1), 106-117 (2001).
  50. Yian, C. H., Paniello, R. C., Gershon Spector, J. Inhibition of motor nerve regeneration in a rabbit facial nerve model. Laryngoscope. 111 (5), 786-791 (2001).
  51. Angelov, D. N., et al. Nimodipine accelerates axonal sprouting after surgical repair of rat facial nerve. Journal of Neuroscience. 16 (3), 1041-1048 (1996).

Play Video

Cite This Article
Ali, S. A., Stebbins, A. W., Hanks, J. E., Kupfer, R. A., Hogikyan, N. D., Feldman, E. L., Brenner, M. J. Facial Nerve Surgery in the Rat Model to Study Axonal Inhibition and Regeneration. J. Vis. Exp. (159), e59224, doi:10.3791/59224 (2020).

View Video