כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבודד תאים דנדריטים טחולים מאתר על ידי מיון מגנטי תא עוקבות המאמצת העברת לתוך תמים עכברים. המודל של תאים דנדריטים מופעל מלח גבוהה נבחר להסביר את ההליכים צעד אחר צעד של cytometry זרימה והעברת המאמצת.
עודף צריכת המלח תזונתיים תורמת דלקת ואת ממלא תפקיד חיוני בהתפתחות של יתר לחץ דם. קודם לכן מצאנו כי אנטיגן תאים דנדריטים (Dc) יכול לחוש נתרן גבוהות חוץ-תאית, המוביל את ההפעלה של אוקסידאז nadph ל היווצרות של isolevuglandin (IsoLG)-חלבון adducts. אלה IsoLG-חלבון adducts מגיבים עם עצמי-חלבונים ולקדם אוטואימונית כמו המדינה ויתר לחץ דם. יש שפותחה ואנו ממוטב המדינה-of-the-art שיטות ללמוד הפונקציה DC ביתר לחץ דם. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבידוד, ב- חוץ גופית הטיפול עם נתרן גבוהות, והעברה המאמצת של הטחול מאתר CD11c+ תאים לתוך עכברים הנמען ללמוד את תפקידם של יתר לחץ דם.
עודף מלח תזונה הוא גורם סיכון עיקרי עבור יתר לחץ דם. 1 , 2 American Heart Association ממליץ 2,300 מיליגרם (מ ג) של צריכת נתרן (Na+) ליום, לכל היותר פחות מ-10% מאוכלוסיית ארה ב מתבונן המלצה זו. 3 , 4 צנוע הפחתות צריכת Na+ להוריד את לחץ הדם, לצמצם את המקרים החדשים השנתי של מחלת לב כלילית, קו בארה ב 20%. 5 בעיה רצינית עם עודף צריכת מלח הוא כי 50% מהאוכלוסיה עם יתר לחץ דם תערוכות מלח-רגישות, כהגדרתו העלאה של 10 מ מ כספית בלחץ הדם בעקבות Na+ טעינה או ירידה דומה בלחץ הדם לאחר Na+ ההגבלה ו diuresis. 6 מלח-רגישות גם מתרחשת ב- 25% של אנשים normotensive, חזאי עצמאית של מוות ושל אירועי לב וכלי דם. 7 , 8 מנגנוני חישה מלח יתר לחץ דם המערבים את הכליה. ובכן נחקרו; אולם, מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי תאי המערכת החיסונית יכולה לחוש Na+. 9 , 10
ממצאים אחרונים מעידים כי השינויים במיוחד כליות נה+ טיפול יכול לגרום להצטברות של Na+ interstitium ולקדם דלקת. 11 , 12 מעבדה שלנו ואחרים הראו כי תאים של שני מולדת, מסתגלת המערכת החיסונית לתרום החרפה של יתר לחץ דם. 9 , 13 , 14 , 15 שונים לחץ דם גבוהה לגירויים, כולל אנגיוטנסין II, נוראדרנלין, כי מלח מקרופאגים, ומונוציטים ו- T לימפוציטים לחדור את הכליות ואת להערכת ולקידום השמירה Na+ , vasoconstriction, לחץ דם העלאת ונזק סוף-איברים. 9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 במחקרים קודמים, מצאנו כי DCs להצטבר isolevuglandin (IsoLG)-חלבון adducts בתגובה לגירויים שונים עם יתר לחץ דם, לרבות אנגיוטנסין II ו- DOCA-מלח יתר לחץ דם. 14 IsoLGs מוצרים מאוד תגובתי של השומנים peroxidation במהירות, covalently adduct כדי lysines על חלבונים, הצטברות שלהם קשורה DC הפעלה. 14 הקמנו לאחרונה כי מוגברות Na+ הוא גירוי חזק עבור IsoLG-חלבון adduct-צורה מאתר Dc-9 Na+ כניסתו DCs מתווך באמצעות מובילי רגיש amiloride. נה+ ואז חילופי לקבלת סידן (Ca2 +) דרך בכל הארץ, ד2 + מחליף נה+. Ca2 + מפעיל קינאז C (PKC) אשר מפעיל את אוקסידאז nadph ל המוביל סופראוקסיד מוגברת (O2· –), IsoLG-חלבון adduct גיבוש. 9 ההעברה המאמצת של מלח החשופים DCs הפריימים יתר לחץ דם בתגובה מנה תת pressor של אנגיוטנסין II. 9
זיהוי של CD11c+ DCs רקמות הוגבלה בעבר אימונוהיסטוכימיה, RT-PCR, בידוד של בקרי קבוצת מחשבים הוגבלה לתא מיון לפי cytometry זרימה. למרות cytometry זרימה מיון תא היא שיטה חזקה הבידוד של תאים חיסוניים, שזה יקר, זמן רב, מה שמוביל תשואה נמוכה של התאים קיימא. לכן, אנו יש אופטימיזציה פרוטוקול צעד אחר צעד עיכול רקמת, גירוי במבחנה של העברה המאמצת של CD11c+ DCs ללמוד ביתר לחץ דם.
בפרוטוקול הנוכחי, לנו יש אופטימיזציה הליכים כדי לבודד CD11c+ DCs מ טחולים של עכברים, adoptively להעביר אותם לתוך תמים חיות ללמוד את התפקיד של בקרי קבוצת מחשבים במלח-induced יתר לחץ דם. פרוטוקול זה ניתן להתאים לבודד ולהעביר adoptively קבוצות משנה אחרים תא החיסון כולל מקרופאגים, ומונוציטים מסתגלת תאים ח…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי איגוד הלב האמריקאי מעניק POST290900 N.R.B., 17SDG33670829 L.X., מכוני הבריאות הלאומיים להעניק K01HL130497 משום מקום
APC/Cy7 anti-mouse CD11c | Biolegend | 117324 | |
autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
CD11c MicroBeads Ultrapure | Miltenyi Biotec | 130-108-338 | |
Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
DNase I | Roche | 10104159001 | |
DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | |
FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
FITC anti-mouse CD45 | Biolegend | 103108 | |
GentleMACS C tube | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
GentleMACS dissociator device | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use protocol: Spleen 04.01 |
LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit | Invitrogen | L34964 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
QuadroMACs Seperator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
RPMI 1640 medium | Gibco | 11835-030 |