Histon translasyonel modifikasyon değişiklikler Maya nörodejeneratif Proteinopathy modellerinde karakterize
Summary
Bu iletişim kuralı genom genelindeki değişiklikleri Histon translasyonel modifikasyonlar ALS ve Parkinson hastalığı ile ilişkili proteinlerin overexpression ile bağlantılı olarak meydana gelen (PTM) düzeyde karakterize etmek için deneysel prosedürler özetliyor Saccharomyces cerevisiae modelleri. SDS-sayfa ayrılıktan sonra bireysel Histon PTM düzeyleri batı kurutma yoluyla değişiklik özel antikorlar ile tespit edilir.
Abstract
Nörodejeneratif hastalıklar, amyotrofik lateral skleroz (ALS) ve Parkinson hastalığı (PD), gibi yüz binlerce her yıl hayatını kaybına neden olur. Etkili tedavi seçenekleri hastalığın ilerlemesini durdurmak için eksik vardır. Büyük hasta nüfus kapsamlı sıralama çabalarına rağmen ALS ve PD vakaların çoğunluğu tarafından Genetik mutasyonlar yalnız açıklanamayan kalır. Histon proteinleri translasyonel modifikasyon gibi epigenetik mekanizmalar nörodejeneratif hastalık etyoloji ve ilerleme içinde tutulabilir ve ilaç müdahale için yeni hedefler için yol. ALS ve PD memeli içinde vivo ve tüp bebek modelleri pahalı ve genellikle uzun ve zahmetli deneysel protokol gerektirir. Burada, genom genelindeki değişiklikler Histon değişiklik düzeylerinde Saccharomyces cerevisiae bir model sistem kullanarak belirlemek için pratik, hızlı ve uygun maliyetli bir yaklaşım anahat. Bu iletişim kuralı epigenetik değişiklikleri ile ilgili bilgilerimizi önemli ölçüde genişletilirken farklı model sistemlerinde önceki bulguları teyit nörodejeneratif proteinopathies bağlı kapsamlı soruşturma için izin verir nörodejeneratif hastalık epigenome.
Introduction
Nörodejeneratif hastalıklar yıkıcı hastalıklar için tedavi seçenekleri yoktur çok az vardır. Bunlar arasında amyotrofik lateral skleroz (ALS) ve Parkinson hastalığı (PD) özellikle korkunç. ALS ve PD olguların yaklaşık % 90 iken kalan servis taleplerini ailelerde çalıştırmak ve genellikle için belirli bir gen mutasyon1,2bağlı olan hastalığı aile öyküsü meydana gelen sporadik olarak kabul edilir. İlginçtir, bu hastalıkların her ikisi de protein mislocalization ve toplama3,4,5,6ile ilişkilidir. Örneğin, sarkomu (FUS) erimiş ve TAR DNA’ya bağlanıcı protein 43 (TDP-43) sonra sitoplazmaya mislocalize ve ALS7,8,9,10‘toplamak RNA proteinler vardır, α-synuclein proteinaceous toplamları Lewy organları PD5,13,14,15‘ olarak adlandırdığı ilke bileşeni ise 11,12,.
Büyük hasta nüfus geniş genom çapında Derneği çabalarına rağmen ALS ve PD durumlarda ezici çoğunluğu genetik olarak açıklanamayan kalır. Epigenetik nörodejeneratif hastalık bir rol oynayabilir? Epigenetik gen ekspresyonu için temel alınan DNA dizisi16değişiklikler meydana gelen değişiklikler oluşur. Bir ana epigenetik mekanizması Histon proteinleri16sonrası translasyonel modifikasyonlar (PTMs) içerir. Ökaryotik hücrelerde genetik materyal Kromatin sıkıca sarılır. Kromatin temel birimi 146 baz çifti DNA buna sarılarak Histon octamer oluşan nucleosome, histonlarla (iki kopyasını her Histon H2A, H2B, H3 ve H4)17dört çift modülüdür. Her Histon nucleosome dışarı çıkıntı ve lizin ve arginin artıkları18üzerinde genellikle çeşitli kimyasal moieties eklenmesi tarafından okunabilen bir N-terminal kuyruğu var. Bu PTMs dinamiktir, yani onlar kolayca eklenebilir ve kaldırıldı ve asetilasyon, metilasyonu ve fosforilasyon gibi gruplar içerir. PTMs DNA transkripsiyon makine için denetlemek ve böylece denetim gen ifade18yardımcı. Örneğin, Histon asetilasyon son derece temel Histon protein ve daha erişilebilir olmasını acetylated Histon tarafından Paketli genler izin olumsuz ücret DNA omurga arasında Elektrostatik etkileşimin gücünü azaltır ve böylece son derece 19dile getirdi. Daha yakın zamanlarda, belirli Histon PTMs ve onların birleştirme dikkat çekici biyolojik özgüllük hangi proteinler bu, silmek, okuyup yazmak tüm konser için hareket Histon PTMs Histon kodu hipotezi20,21 yol açmıştır gen ifadesinin modüle.
Maya ateş eğitim için çok kullanışlı bir modeldir. Önemlisi, birçok nöronal hücresel yolları Maya insanlar22,23,–24korunmuş. Maya özetlemek sitotoksisite fenotipleri ve overexpression üzerine protein kapanımlar FUS, TDP-43 veya α-synuclein22,23,24,25,26. Aslında, ALS Saccharomyces cerevisiae modelleri insanlar27genetik risk faktörleri tanımlamak için kullanılmaktadır. Ayrıca, insan α-synuclein Rsp5 ağ karakterizasyonu druggable hedef olarak α-synuclein toksisite nöronlar28,29iyileştirmek için izin verilen overexpressing Maya.
Burada, nörodejeneratif proteinopathies (şekil 1) ile ilişkili genom çapında Histon PTM değişiklikleri algılamak için Saccharomyces cerevisiae istismar bir protokol açıklayın. S. cerevisiae kullanımı onun rahatlık-in kullanma, düşük maliyetli ve ateş diğer tüp bebek ve hayvan modellerle karşılaştırıldığında hız nedeniyle son derece çekici olduğunu. Daha önce harnessing geliştirilen ALS ve PD modelleri22,23,25,26, insan FUS, TDP-43 ve α-synuclein Maya ve ele geçen farklı Histon PTM değişiklikler meydana overexpressed Her proteinopathy30ile bağlantı. Biz burada tarif protokolü veri analizi dönüşümü az iki hafta içinde tamamlanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokol genom çapında Histon PTM değişiklikleri nörodejeneratif proteinopathies ile ilişkili kategorilere, basit, uygun ve uygun maliyetli bir yolu sağlar. ALS ve PD diğer modelleri olmakla birlikte, vitro gibi insan hücre satırları ve fare modelleri32, S. cerevisiae kalır kullanım kolaylığı nedeniyle çekici. Örneğin, Maya modelleri steril bir başlık kullanılması gerekli değil, ne de onlar eğitim yoğun hücre kültür çalışmalar il…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Teknik yardım için Royena Tanaz, Huda Yousuf ve Sadiqa Taasen teşekkür ederim. Prof. James Shorter reaktifler ve sukroz ayarlama deneyler tasarım fikri yardım cömert sağlanması için minnettarız. Maya plazmid Prof. Dr. Aaron (303 Gal-FUS; dahil Gitler cömert bir hediye edildi Addgene plazmid # 29614). Brooklyn College ve gelişmiş Bilim Araştırma Merkezi (CUNY) yanı sıra bir NIH NINDS gelişmiş doktora sonrası geçiş Ödülü (K22NS09131401) M.P.T. desteklenen
Materials
| -His DO Supplement | Clontech | 630415 | |
| 10x Running Buffer | Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8. | ||
| 12% Polyacrylamide Gels | BIO-RAD | 456-1041 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody | MilliporeSigma | 07-353 (Lot No. 2762291) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody | Abcam | ab109463 (Lot No. GR187780) | Dilution: 1/2000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody | Abcam | ab46983 (Lot No. GR71882) | Dilution: 1/5000 |
| Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody | Abcam | ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-Histone H3 Primary Antibody | Abcam | ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335) | Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000 |
| Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody | Abcam | ab188292 (Lot No. GR211874) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody | Abcam | ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296) | Dilution: 1/1000 |
| BioPhotometer D30 | Eppendorf | 6133000010 | |
| Cell Culture Dish (100 x 20 mm) | Eppendorf | 30702118 | |
| Cell Culture Plate, 96 well | Eppendorf | 30730011 | |
| Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
| Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW | LI-COR | 926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05) | Dilution: 1/5000 |
| Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD | LI-COR | 926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07) | Dilution: 1/2500 |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Extra thick blot paper (filter paper) | BIO-RAD | 1703968 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Prepare 50 % w/v solution. |
| Immobilon-FL Transfer Membranes | MilliporeSigma | IPFL00010 | |
| Lithium acetate dihydrate (LiAc) | Sigma-Aldrich | L4158 | Prepare a 1 M solution. |
| Loading Dye | Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water. | ||
| Methanol | ThermoFisher | A412-4 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell | BIO-RAD | 1658004 | |
| Multichannel pipet | Eppendorf | 2231300045 | |
| NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x | New England Bio Labs | 102855-152 | |
| Nhe I Restriction Enzyme | New England Bio Labs | 101228-710 | |
| Nuclease Free Water | Qiagen | 129114 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | 2800-03 | |
| OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm) | ThermoFisher | 165218 | |
| pAG303GAL-a-synuclein-GFP | Gift from A. Gitler | ||
| pAG303GAL-ccdB | Addgene | 14133 | |
| pAG303Gal-FUS | Addgene | 29614 | |
| pAG303GAL-TDP-43 | Gift from A. Gitler | ||
| Poly(ethylene glycol) (PEG) | Sigma-Aldrich | P4338 | Prepare a 50% w/v solution. |
| Ponceau S Stain | Sigma-Aldrich | P3504 | Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water. |
| PowerPac Basic Power Supply | BIO-RAD | 164-5050 | |
| Raffinose pentahydrate | Sigma-Aldrich | R7630 | Prepare 10% w/v stock solution. |
| Salmon Sperm DNA | Agilent Tech | 201190 | |
| SD-His plates | Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water. | ||
| SGal-His plates | Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water. | ||
| Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer | Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8. | ||
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Prepare 0.2 M solution. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| TBS + 0.1% Tween 20 (TBST) | Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water. | ||
| TBS Blocking Buffer | LI-COR | 927-5000 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | BIO-RAD | 170-3940 | |
| Transfer Buffer | Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water. | ||
| Tris-Buffered Saline (TBS) | 10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water. | ||
| WT 303 S. cerevisiae yeast | Gift from J. Shorter | ||
| Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) | Sigma-Aldrich | Y1375 |
References
- Landgrave-Gómez, J., Mercado-Gómez, O., Guevara-Guzmán, R. Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 58 (2015).
- Paez-Colasante, X., Figueroa-Romero, C., Sakowski, S. A., Goutman, S. A., Feldman, E. L. Amyotrophic lateral sclerosis: mechanisms and therapeutics in the epigenomic era. Nature Reviews Neurology. 11 (5), 266-279 (2015).
- Beitz, J. M. Parkinson’s Disease: a Review. Frontiers in Bioscience. 6, 65-74 (2014).
- Kim, H. J., et al. Mutations in prion-like domains in hnRNPA2B1 and hnRNPA1 cause multisystem proteinopathy and ALS. Nature. 495 (7442), 467-473 (2013).
- Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013 (2017).
- Robberecht, W., Philips, T. The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis. Nature Reviews Neuroscience. 14 (4), 248-264 (2013).
- Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).
- Couthouis, J., et al. A yeast functional screen predicts new candidate ALS disease genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (52), 20881-20890 (2011).
- Da Cruz, S., Cleveland, D. W. Understanding the role of TDP-43 and FUS/TLS in ALS and beyond. Current Opinion in Neurobiology. 21 (6), 904-919 (2011).
- King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. The tip of the iceberg: RNA-binding proteins with prion-like domains in neurodegenerative disease. Brain Research. 1462, 61-80 (2012).
- Neumann, M., et al. FET proteins TAF15 and EWS are selective markers that distinguish FTLD with FUS pathology from amyotrophic lateral sclerosis with FUS mutations. Brain. 134 (9), 2595-2609 (2011).
- Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130-133 (2006).
- Baba, M., et al. Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson’s disease and dementia with Lewy bodies. The American Journal of Pathology. 152 (4), 879-884 (1998).
- Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of parkinson’s disease: dopamine, vesicles and α-synuclein. Nature Reviews Neuroscience. 3 (12), 932-942 (2002).
- Spillantini, M. G., et al. α-Synuclein in Lewy bodies. Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).
- Probst, A. V., Dunleavy, E., Almouzni, G. Epigenetic inheritance during the cell cycle. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (3), 192-206 (2009).
- Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Mazzio, E. A., Soliman, K. F. A. Basic concepts of epigenetics. Epigenetics. 7 (2), 119-130 (2012).
- Struhl, K. Histone acetylation and transcriptional regulatory. Genes & Development. 12 (5), 599-606 (1998).
- Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (1), 66-73 (2007).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
- Sanchez, Y., Lindquist, S. L. HSP104 required for induced thermotolerance. Science. 248 (4959), 1112 (1990).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology. Science. 302 (5651), 1772 (2003).
- Johnson, B. S., et al. TDP-43 Is Intrinsically Aggregation-prone, and Amyotrophic Lateral Sclerosis-linked Mutations Accelerate Aggregation and Increase Toxicity. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20329 (2009).
- Sun, Z., et al. Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS. PLOS Biology. 9 (4), e1000614 (2011).
- Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466 (7310), 1069-1075 (2010).
- Wijayanti, I., Watanabe, D., Oshiro, S., Takagi, H. Isolation and functional analysis of yeast ubiquitin ligase Rsp5 variants that alleviate the toxicity of human α-synuclein. The Journal of Biochemistry. 157 (4), 251-260 (2015).
- Tardiff, D. F., et al. Yeast Reveal a “Druggable” Rsp5/Nedd4 Network that Ameliorates α-Synuclein Toxicity in Neurons. Science. 342 (6161), 979 (2013).
- Chen, K., et al. Neurodegenerative Disease Proteinopathies Are Connected to Distinct Histone Post-translational Modification Landscapes. ACS Chemical Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018).
- Flick, J. S., Johnston, M. Two systems of glucose repression of the GAL1 promoter in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 10 (9), 4757 (1990).
- Fernandez-Santiago, R., Ezquerra, M. Epigenetic Research of Neurodegenerative Disorders Using Patient iPSC-Based Models. Stem Cells International. 2016, 9464591 (2016).
- Armakola, M., et al. Inhibition of RNA lariat debranching enzyme suppresses TDP-43 toxicity in ALS disease models. Nature Genetics. 44 (12), 1302-1309 (2012).
- Tibshirani, M., et al. Cytoplasmic sequestration of FUS/TLS associated with ALS alters histone marks through loss of nuclear protein arginine methyltransferase 1. Human Molecular Genetics. 24 (3), 773-786 (2015).
- Masala, A., et al. Epigenetic Changes Associated with the Expression of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) Causing Genes. Neuroscience. 390, 1-11 (2018).
- Eryilmaz, I. E., et al. Epigenetic approach to early-onset Parkinson’s disease: low methylation status of SNCA and PARK2 promoter regions. Neurological Research. 39 (11), 965-972 (2017).
- Daniele, S., et al. Epigenetic Modifications of the α-Synuclein Gene and Relative Protein Content Are Affected by Ageing and Physical Exercise in Blood from Healthy Subjects. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 3740345 (2018).
