효 모 신경 Proteinopathy 모델에서 특성화 히스톤 포스트 번역 상 수정 변경
Summary
이 프로토콜의 히스톤 포스트 번역 상 수정 (PTM) ALS와 파 킨 슨 병에 관련 된 단백질의 overexpression 관련 하 여 발생 하는 수준에서 게놈 넓은 변화 하는 실험 절차 설명 Saccharomyces cerevisiae 모델입니다. SDS 페이지 분리 후 개별 히스톤 PTM 수준은 통해 서 부 럽 수정-특정 항 체와 검색 됩니다.
Abstract
신경 퇴행 성 질환, 파 킨 슨 병 (PD), 루 경화 증 (ALS) 등 생활 매년 수천의 수백의 손실. 효과적인 치료 옵션 수 질병의 진행을 중단 하는 부족. 대형 환자 집단에서 광범위 한 시퀀싱 노력에도 불구 하 고 대부분의 ALS 및 PD 경우 혼자 유전자 변이 의해 설명할 수 없는 남아 있습니다. Epigenetics 메커니즘, 히스톤 단백질의 포스트 번역 상 수정 같은 신경 퇴행 성 질환 병 인 및 진행에 관련 되어있을 수 있습니다 고 제약 개입에 대 한 새로운 목표. ALS와 PD의 포유류 vivo에서 그리고 생체 외에서 모델은 비용이 많이 드는 연장과 힘 드는 실험 프로토콜 요구. 여기, 우리는 게놈 넓은 변경 Saccharomyces cerevisiae 를 사용 하 여 모델 시스템으로 하는 히스톤 수정 레벨을 결정 하는, 빠르고, 실용적이 고 비용 효율적인 접근을 개설 한다. 크게의 우리의 지식을 확대 하는 동안 다른 모델 시스템에서 이전 연구 결과 확증 신경 proteinopathies에 연결 하는 epigenetic 변화에 포괄적인 수사를 위해이 프로토콜을 사용 하는 신경 퇴행 성 질병 epigenome입니다.
Introduction
신경 퇴행 성 질환 거의 아무 치료 옵션을 사용할 수 있는 치명적인 질병이 있습니다. 이러한 가운데, 루 경화 증 (ALS) 및 파 킨 슨 병 (PD)는 특히 무서운. ALS와 PD의 경우의 약 90% 산발적, 나머지 경우 가족에서 실행 하 고 일반적으로 특정 유전자 돌연변이1,2에 연결 하는 동안, 질병의 가족 력이 없이 발생으로 간주 됩니다. 흥미롭게도,이 질병의 두 단백질 mislocalization 및 집계3,4,,56와 연결 됩니다. 예를 들어, 육 (FUS)에 융합 및 타르 DNA 묶는 단백질 43 (TDP-43)는 세포질에 mislocalize ALS7,,89,10에서 집계 하는 RNA 의무적인 단백질 11,12, α-synuclein는 배치할 PD5,13,,1415Lewy 몸 불리의 원리 구성 요소.
대형 환자 집단에서 광범위 한 게놈 넓은 협회 노력에도 불구 하 고 압도적인 대부분의 ALS 및 PD 경우 남아 설명할 수 없는 유전자. Epigenetics는 신경 질환에 역할을 할 수 있습니다.? Epigenetics는 원본 DNA 시퀀스16변경 없이 발생 하는 유전자 발현에서 변화 구성 되어 있습니다. 주요 epigenetic 메커니즘 히스톤 단백질16의 포스트 번역 상 수정을 (PTMs)를 포함 한다. 진 핵 세포에서 유전 물질 염색 질으로 단단히 싸여 있다. Chromatin의 기본 단위는 DNA는 히스톤 octamer 감싸의 146의 기본적인 쌍의 구성 된 nucleosome 히스톤 (2 부 각 히스톤 H2A, H2B, H3, H4)17의 4 쌍의 구성입니다. 각 히스톤이 있다 N 맨끝 꼬리는 nucleosome 중 돌출 하 리 신과 아르기닌 잔류물18에 일반적으로 다양 한 화학 moieties의 추가 의해 수정할 수 있습니다. 이러한 PTMs 이므로 동적, 그들은 쉽게 추가 될 수 있습니다 및 제거, 그룹 acetylation, 메 틸 화, 인 산화 등을 포함. PTMs transcriptional 기계, DNA의 접근을 제어 하 고 따라서 제어 유전자 식18도움. 예를 들어 histone acetylation 매우 기본적인 히스톤 단백질 및 유전자 더 액세스할 수 acetylated 히스톤에 의해 포장 수 있도록 부정 청구 DNA 등뼈 사이 정전기 상호 작용의 힘을 감소 따라서 매우 19를표현 했다. 최근에, 특정 히스톤 PTMs 및 그들의 조합의 놀라운 생물 특이성 히스톤 코드 가설20,21 어떤 단백질에서을 작성, 삭제, 및 읽기 히스톤 PTMs 모든 콘서트에서 행동을 주도하 고 있다 유전자 발현 조절
효 모 neurodegeneration 공부에 매우 유용한 모델 이다. 중요 한 것은, 많은 신경 세포 통로 인간22,,2324누 룩에서 보존 됩니다. 효 모 세포 독성 고기 및 FUS, TDP-43, 또는 α-synuclein22,,2324,,2526의 overexpression에 단백질 포함 정리. 사실, ALS의 Saccharomyces cerevisiae 모델 인간27에서 유전 위험 요소를 식별 하기 위해 사용 되었습니다. 또한, 인간의 α-synuclein ameliorate α-synuclein 독성 신경28,29druggable 대상으로 Rsp5 네트워크의 특성에 대 한 허용 overexpressing 효 모.
여기, 우리가 Saccharomyces cerevisiae 신경 proteinopathies (그림 1)과 관련 된 게놈 넓은 히스톤 PTM 변화를 감지를 악용 하는 프로토콜을 설명 합니다. S. cerevisiae 의 사용 때문에 그것의 사용의 용이성, 저렴 한 비용과 속도 neurodegeneration의 다른 시험관 및 동물 모델에 비해 매우 매력적 이다. ALS와 PD 모델22,23,,2526개발 이전 활용, 우리 인간의 FUS, TDP-43, 및 효 모에 발견된 고유 히스톤 PTM 변화에서 발생 하는 α-synuclein overexpressed 있다 각 proteinopathy30와 연결입니다. 우리가 여기에 설명 하는 프로토콜은 데이터 분석에 변환에서 2 주 미만에 완료할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 프로토콜의 게놈 넓은 히스톤 PTM 변화 신경 proteinopathies 연관 분류, 편법, 간단 하 고 비용 효율적인 방법을 제공 합니다. 그러나 거기에 다른 모델의 ALS 및 PD, 등 생체 외에서 인간 세포 선 및 murine 모델32, S. cerevisiae 남아 사용의 용이성 때문에 매력적인. 예를 들어, 효 모 모델 살 균 후드의 사용을 요구 하지 않습니다 없으며 그들은 필요로 할 교육 집…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 기술 Royena Tanaz, Huda 유세 프 및 Sadiqa Taasen 감사합니다. 우리는 시 약 및 자당 튜닝 실험의 디자인에서 지적 도움의 관대 한 제공에 대 한 교수 제임스 짧은에 매우 감사. 효 모 플라스 미드 교수 아론 Gitler (303 Gal FUS;를 포함 하 여에서 관대 한 선물을 했다 Addgene 플라스 미드 # 29614)입니다. NIH NINDS 고급 박사 전환 수상 (K22NS09131401) 뿐 아니라 고급 과학 연구 센터 (CUNY)와 브루클린 대학 지원 M.P.T.
Materials
| -His DO Supplement | Clontech | 630415 | |
| 10x Running Buffer | Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8. | ||
| 12% Polyacrylamide Gels | BIO-RAD | 456-1041 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody | MilliporeSigma | 07-353 (Lot No. 2762291) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody | Abcam | ab109463 (Lot No. GR187780) | Dilution: 1/2000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody | Abcam | ab46983 (Lot No. GR71882) | Dilution: 1/5000 |
| Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody | Abcam | ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-Histone H3 Primary Antibody | Abcam | ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335) | Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000 |
| Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody | Abcam | ab188292 (Lot No. GR211874) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody | Abcam | ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296) | Dilution: 1/1000 |
| BioPhotometer D30 | Eppendorf | 6133000010 | |
| Cell Culture Dish (100 x 20 mm) | Eppendorf | 30702118 | |
| Cell Culture Plate, 96 well | Eppendorf | 30730011 | |
| Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
| Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW | LI-COR | 926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05) | Dilution: 1/5000 |
| Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD | LI-COR | 926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07) | Dilution: 1/2500 |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Extra thick blot paper (filter paper) | BIO-RAD | 1703968 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Prepare 50 % w/v solution. |
| Immobilon-FL Transfer Membranes | MilliporeSigma | IPFL00010 | |
| Lithium acetate dihydrate (LiAc) | Sigma-Aldrich | L4158 | Prepare a 1 M solution. |
| Loading Dye | Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water. | ||
| Methanol | ThermoFisher | A412-4 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell | BIO-RAD | 1658004 | |
| Multichannel pipet | Eppendorf | 2231300045 | |
| NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x | New England Bio Labs | 102855-152 | |
| Nhe I Restriction Enzyme | New England Bio Labs | 101228-710 | |
| Nuclease Free Water | Qiagen | 129114 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | 2800-03 | |
| OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm) | ThermoFisher | 165218 | |
| pAG303GAL-a-synuclein-GFP | Gift from A. Gitler | ||
| pAG303GAL-ccdB | Addgene | 14133 | |
| pAG303Gal-FUS | Addgene | 29614 | |
| pAG303GAL-TDP-43 | Gift from A. Gitler | ||
| Poly(ethylene glycol) (PEG) | Sigma-Aldrich | P4338 | Prepare a 50% w/v solution. |
| Ponceau S Stain | Sigma-Aldrich | P3504 | Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water. |
| PowerPac Basic Power Supply | BIO-RAD | 164-5050 | |
| Raffinose pentahydrate | Sigma-Aldrich | R7630 | Prepare 10% w/v stock solution. |
| Salmon Sperm DNA | Agilent Tech | 201190 | |
| SD-His plates | Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water. | ||
| SGal-His plates | Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water. | ||
| Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer | Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8. | ||
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Prepare 0.2 M solution. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| TBS + 0.1% Tween 20 (TBST) | Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water. | ||
| TBS Blocking Buffer | LI-COR | 927-5000 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | BIO-RAD | 170-3940 | |
| Transfer Buffer | Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water. | ||
| Tris-Buffered Saline (TBS) | 10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water. | ||
| WT 303 S. cerevisiae yeast | Gift from J. Shorter | ||
| Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) | Sigma-Aldrich | Y1375 |
References
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