Summary

Сингл-пропускная способность взаимодополняющих разрешением аналитические методы характеризующие сложных природных органических веществ смеси

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

Этот протокол описывает один пропускной способности для дополнительных аналитических и омику методов, кульминацией которых полностью паре характеристика природных органических веществ и микроорганизмов протеомики в различных экосистемах. Этот подход позволяет надежного сравнения для выявления метаболических и преобразований важно для описания парниковых газов производства и прогнозирования реакции на изменения окружающей среды.

Abstract

Природные органические вещества (NOM) состоит из очень сложной смеси тысяч органических соединений, которые, исторически, трудно характеризовать. Однако чтобы понять термодинамические и кинетические элементы управления производства парниковых газов (диоксид углерода [CO2] и метана [CH4]) в результате разложения NOM, характеристика молекулярном уровне в сочетании с микробной необходим анализ протеома. Кроме того ожидается, что климатических и экологических изменений, возмущают природных экосистем, потенциально нарушить сложных взаимодействий, которые влияют на поставку субстраты органического вещества и микроорганизмы, выполнение преобразований. Необходимо предсказать направление и масштабы последствий экологических изменений будет подробный молекулярная характеристика органических веществ, микробной протеомики, пути и преобразований, которые разлагаются органического вещества. Эта статья описывает методологических пропускную способность для характеризации всеобъемлющей метаболит в одном образце путем прямого впрыска Фурье преобразование Ион циклотронный резонанс масс-спектрометрия (FTICR-MS), газовой хроматографии с масс-спектрометрии (ГХ-МС), спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР), жидкостной хроматографии с масс-спектрометрия (LC-MS) и анализ протеомики. Этот подход приводит к полностью в паре dataset, которая улучшает статистические уверенность для выведения тропы разложения органического вещества, результате CO2 и CH4 темпы производства, и их ответы на экологические возмущений. Здесь мы представляем результаты применения этого метода для NOM пробах из торфяников; Однако протокол применяется к любой NOM выборки (например, торф, лесных почвах, морских отложений и т.д.).

Introduction

Глобально водно-болотных угодий оценкам содержат 529 Pg углерода (C), главным образом органического углерода, похоронен в торфяных месторождений1. В настоящее время такие торфяники действовать как чистая раковина C, улавливание 29 Tg C y-1 в Северной Америке только1. Однако экологические нарушения таких слив, пожары, засухи и повышение температуры может компенсировать это раковина C путем увеличения разложение органических веществ, что приводит к увеличению потерь через C парниковых газов (диоксид углерода [CO2] и 1,производство метана [CH4])2. Изменение климата может способствовать потере C Если повышение температуры или сушка условий стимулирования быстрее C разложение микроорганизмами. Кроме того более высокие температуры и концентрации в воздухе CO2 может стимулировать первичного производства улавливания больше CO2 в качестве органического углерода (ОУ). В какой степени и как быстро что OC затем разложить на CO2 и CH4 зависит от сложного взаимодействия между субстратов доноров электронов, доступность акцепторов электронов и микроорганизмы, которые посредником преобразование. Во многих случаях механизмы не являются хорошо изученных, таким образом их реакции на экологические потрясения не хорошо ограниченного и остается неясным, что в результате изменения климата будет на баланс углерода в экосистемы болота.

Сложный характер природных органических веществ (NOM) сделал даже идентификации органических соединений, присутствующих в исторически трудных NOM-смеси. Последние достижения значительно улучшили нашу способность, традиционно характеризуют соединений и, в определенной степени по-прежнему рассматриваться как непокорных гуминовых фульвовых соединений3,,4или5. Теперь мы понимаем, что многие из этих соединений фактически микробиологически доступен и может быть разложено, если подходящий терминал электрон акцептора (чай) производится доступны6,7. Расчет номинального окисления углерода (NOSC) для соединения предоставляет метрики для прогнозирования потенциал для разложения и выход энергии требуется чая. Однако это требует молекулярном уровне характеристика органических веществ7. NOSC рассчитывается от Молекулярная формула через следующее уравнение7: NOSC = − ((−z + 4(#C) + (#H) − 3(#N) − 2(#O) + 5(#P) − 2(#S)) / (#C)) + 4, где z — Чистая бесплатно. NOSC коррелирует с термодинамических движущей силой8, которой соединений с более высокой NOSC легче деградируют, хотя соединений с Нижняя NOSC требуют более энергичных чаи для того, чтобы быть сокращены. Соединения с NOSC менее чем −2 требуют высокой энергии, уступая чаи как O2, нитрат или MnIVи не должно ухудшаться часто встречающихся меньше энергии, уступая чаи, такие как FeIII или сернокислый7. Это является важным фактором в заболоченных анаэробных условиях в водно-болотных угодий, где O2 и других высоких энергий, уступая чаи являются скудными9 и, следовательно, ухудшение состояния нижней NOSC соединений в этих условиях термодинамически ограничены. Экологические возмущений могут влиять термодинамического состояния экосистемы через гидрологических изменений, которые влияют O2 (наиболее энергичных акцептора электронов), изменения в органических субстратов и акцепторов электронов, доступны на начальной производство и в меньшей степени температуры. Важным примером температурных эффектов в водно-болотных угодий системах происходит в отношении компромисса, который происходит между homoacetogenesis (то есть, ацетат производство с CO2 и Ч.2) и hydrogenotrophic (при этом освобождается метан то есть, CH4 производства с CO2 и Ч.2). При низких температурах он кажется что homoacetogenesis слегка выступает, в то время как потепление пользу CH4 производства10. Этот эффект температуры могут иметь важные последствия для реакции экосистем к изменению климата, как CH4 является парниковым газом гораздо сильнее, чем CO211 и, следовательно, увеличения производства CH4 на счет по CO2 при повышенной температуре может способствовать положительной обратной связи с потеплением климата.

Болот производят глобально значительное количество CO2 и CH46через микробной дыхание естественным органическим вопрос. NOSC субстраты органического углерода определяет относительную долю CO2: CH4 производства, который является критическим параметром из-за более высоких радиационное CH4 по сравнению с CO211, но и потому, что Моделирование усилия определили это соотношение как критический параметр для оценки потока C в торфяниках12. В отсутствие акцепторов электронов терминала помимо CO2, он может быть отображено электрона баланс органических субстратов C с NOSC > 0 будет производить CO2: CH4 > 1, органического углерода с NOSC = 0 производит CO2 и CH4 в эквимолярных соотношение и органического углерода с NOSC < 1 будет производить CO2: CH4 < 113. Разложение OC в природных экосистемах опосредовано микроорганизмов, так что даже когда деградация конкретного соединения термодинамически возможна, она кинетически ограничивается деятельность микробных ферментов и в анаэробных условиях, по термодинамические движущей силы (т.е., NOSC)7. До сих пор сложно полностью характеризуют органического вещества, потому что разнообразие составляющих требует различных дополнительных методов для их описания. Последние достижения закрыли этот разрыв; с помощью набора аналитических методов мы можем анализировать большой ассортимент органических соединений, обеспечивая молекулярном уровне квалификации и, в некоторых случаях количественной оценки, от небольших первичных метаболитов как глюкозы до 800 да поли гетероциклов. Ранее такие большие сложные молекулы бы характеризуются просто как лигнин как или танин как и предполагаемой были непокорных. Характеристика молекулярно уровня, однако, позволяет расчета NOSC даже этих больших сложных молекул. Эти значения NOSC линейно коррелируют с термодинамическим движущей силой, позволяя для оценки качества органических веществ для разложения, которые во многих случаях показывает, что эти сложные молекулы фактически может быть микробиологически разложению даже в анаэробных условиях, которые преобладают в водно-болотных угодий.

Поскольку введение O2 позволяет органического вещества почти все естественно наблюдаемых значений NOSC чтобы разложить, здесь мы сосредоточиться на изменения в органических веществ и микроорганизмов протеомики, которые, скорее всего быть основными причинами в водно-болотных угодий (т.е., ограниченное O2) систем. Однако все методы, которые мы будем обсуждать может применяться для органического вещества из любой экосистемы. Обычно массовых измерений на основе оптических и флуоресценции анализы были использованы для оценки качества органического вещества3,14. При использовании массовых измерений такие, однако мелкие детали теряются как большое количество молекул классифицируются вместе под общие термины как гуматы или fulvics. Определения этих категорий не являются хорошо ограничением и в самом деле, могут отличаться от исследования для изучения сравнение невозможно. Кроме того массовых измерений не обеспечивают молекулярных деталях, необходимых для расчета термодинамики, регулирующие системы и поэтому оправдывают поистине оценки качества органических веществ15.

Отдельные методы, такие как Фурье преобразование ионного циклотронного резонанса масс-спектрометрии (FTICR-MS), спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР), газовая хроматография массовые спектрометрии (ГХ-МС) и делать жидкостной хроматографии с масс-спектрометрия (LC-MS) предоставления такого молекулярного уровня детализации. Хотя каждый из этих методов представляет свои собственные ограничения, они также приносят свои сильные стороны, которые могут быть использованы в рамках комплексного подхода для достижения тонкой молекулярных деталях, необходимых для количественной оценки качества органического вещества в строгий термодинамических смысле . GC-MS полезен для выявления критических малых метаболитов, которые, вероятно, проксимальной влияние на CO2 и CH4 производства (например, глюкоза, ацетат и т.д.); Однако GC-MS требует проверки против стандарта и поэтому ограничивается уже известных соединений, присутствующих в базе предотвращения идентификации новых соединений. Кроме того GC-MS — полу качественная техника позволяя вывод об изменениях в относительной концентрации, но не предоставляет фактической концентрацией необходимую информацию для вычисления Гиббса свободной энергии, например. Наконец GC-MS требует деривации молекул до анализа, который ограничивает резолюции соединений меньше ~ 400 да и летучих спирты теряются во время сушки шага.

Одномерный (1D) 1H ЯМР жидкое состояние позволяет высоко количественных характеристик мелких метаболитов (включая первичный небольшой молекулярной массой метаболитов и летучих веществ как спирты, ацетат, ацетон, формате, пируват, сукцинат, короткоцепные жирных кислот, а также широкий спектр углеводов заведомо отсутствует или нарушенной из методов на основе MS) и особенно полезны для вычисления термодинамических параметров их концентрации. Тем не менее как и GC-MS, ЯМР 1D сложных смесей требует стандартизации по отношению к базе данных и поэтому самостоятельно не позволяют легко идентифицировать новых соединений, которые могут быть обильные в сложных природных и изменение экосистем. Кроме того, менее чувствительны, чем MS-методы на основе ЯМР и таким образом, количественные метаболит профилирование достигается только выше 1 мкм с помощью ЯМР систем, оснащенных гелий охлаждаются холодной зондов. Оценил не широко, некоторые холодной ЯМР-зонды солеустойчивое и позволяют проводить анализ экологической смеси в присутствии millimolar концентрация соли при использовании меньшего диаметра (< 3 мм Наружный диаметр) образец трубы16. Однако, дальнейшее осложнение ЯМР является то, что большое количество парамагнитных металлов и минералов (например, Fe и Mn выше 1-3 wt %), которые могут быть обильные в горных почв, можно расширить спектральные характеристики и усложнить толкование спектров ЯМР . С помощью твердой фазы экстракции (SPE) могут помочь в интерпретации ЯМР и на основе MS метаболомики методы уменьшая минеральных солей и увеличивая спектрального качества.

FTICR-MS путем прямого впрыска чувствительный техника способны обнаруживать десятки тысяч метаболитов от одного образца, но он не захватить критических небольшой метаболитов например ацетат, пируват и сукцината и сложно использовать для сахара и других углеводов17, и она не обеспечивает количественной информации. Однако в отличие от других методов, FTICR-MS выделяется на определение и назначение Молекулярная формула Роман соединений и таким образом определяет наибольшее количество соединений, обеспечивая более молекулярных информации, чем любой из описанных методов. Это полезно, потому что молекулярные, представленная FTICR-мс (и другие методы) может использоваться для вычисления NOSC, которое связано с термодинамическим движущей силой, управляющих вероятность определенных реакций8 и их ставки при определенных 7условия. Кроме того путем соединения FTICR-MS с разделение методов, таких как LC вместе с тандем МС, количественные структурная информация может быть достигнуто, компенсировать некоторые из недостатков этого метода. LC-MS полезен для выявления соединений липидов как и другие метаболиты, которые не являются хорошо изученных любым из других методов. Муфта FTICR LC-MS или LC-MS с коллектор фракций и сбора фракций конкретных неизвестных интерес для структурных разяснения двухмерный (2D) жидкого состояния, которую ЯМР-это идеальная ситуация для идентификации и количественного определения неизвестных соединений18 ,19. Однако это очень много времени шаг, который может использоваться при необходимости. Взятые по отдельности, каждый из этих методов предоставляют различные снимок органического вещества, и путем их интеграции, мы можем достичь более полного понимания, чем с помощью любого из методов в изоляции.

В то время как термодинамические вопросы задать конечной ограничения на какие преобразования возможны в системе, разложения органических веществ при посредничестве микроорганизмов, чья деятельность фермента контролировать скорость реакции. Таким образом, полного понимания элементов управления на разложение органического вещества и в конечном итоге парниковых газов (CO2 и CH4) производства от водно-болотных угодий требует комплексной омику подхода к характеристике микробной ферментативной активности, а также метаболиты. В этой статье мы описываем метод для достижения такого всеобъемлющего анализа от одного образца, используя последовательный подход, который приводит к полностью парных анализа. Такой подход расширяет метаболит, белков и липидов протокол извлечения (MPLex) в котором протеомики был увязан с GC-MS и LC-MS20 для выявления мелких метаболитов, белки и липиды путем включения количественных метаболит информации через ЯМР и идентификации крупных вторичных метаболитов через FTICR-г-жа слегка отличается от MPLex, мы начинаем протокол с водной вытяжке и затем использование последовательного извлечения с все более неполярных растворителей. Все экстракции производится на один образец, который экономит пример, когда объемы являются ограниченными или трудно получить и уменьшается экспериментальной ошибки представил через различия между аликвоты из гетерогенных образец матрицы (например, почвы и торф) или различия в условиях хранения и продолжительности.

Наконец путем соединения ом анализов с протеомики анализов микробных, мы можем построить метаболических сетей, которые описывают пути и преобразование разложения органического вещества. Это позволяет нам проверить определенных гипотез о влияние возмущений в систему конечной CO2 и CH4 производства путем изменения имеющихся органических субстратов, акцепторов электронов и микробных сообществ посредничество по реакции через активность фермента катализаторов.

Общая цель этого метода является предоставить единый пропускной способности протокол для анализа метаболитов, липиды и микробных белков от одного образца, создавая тем самым полностью парных dataset для создания метаболических сетей хотя ограничение анализа ошибок .

Protocol

1. последовательное извлечение органического вещества из почвы, отложений или торфа Собирать почвы, отложений или торфа через керна и деление ядер согласно гипотезе проходит проверку (например, глубина). Хранить образцы в политетрафторэтилена покрытием контейнеров и за?…

Representative Results

Мы выступали описывается дополнительный анализ протокола и сравнении торфа с глубиной в болоте S1 в узле ель и торфяников ответ под изменения среды (ель) в штате Миннесота, США. Эти результаты сравниваются с теми из вечной мерзлоты трясин и низинных болот от Северной Швеции, чтобы показа?…

Discussion

Сингл-пропускная способность, полностью сочетании анализ поток, используемый для характеристики метаболитов и протеом обеспечивает понимание путей, на которых C Велоспорт происходит в сложных экосистем. Почвы и торфа гетерогенной матрицы, и таким образом, одним из важнейших шагов дан?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить Chanton Ю.П., ю.е. Костки и м.м. Kolton за помощь в сборе образцов торфа. Часть этой работы были проведены на экологические лаборатории молекулярной наук, Доу из науки пользователя офис под эгидой Бюро биологических и экологических исследований. PNNL эксплуатируется Battelle для Доу под контракт де-AC05-76RL01830. Эта работа была поддержана министерства энергетики США, Отделение науки и управления биологических и экологических исследований (гранты: DE-AC05-00OR22725, де-SC0004632, DESC0010580, де-SC0012088 и де-SC0014416).

Materials

methoxyamine hydrochloride Sigma Aldrich 226904 derivitization agent
5 mm triple resonance salt-tolerant cold probe  Bruker instrumentation
capillary GC column HP-5MS column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) Agilent AG19091S-433 instrumentation
reversed phase charged surface hybrid column (3.0 mm × 150 mm × 1.7 μm particle size) ThermoFisher instrumentation
2 mL glass vials VWR International 46610-722 sample vials
autosampler vials VWR International 97055-324; 9467671 sample vials
Chloroform VWR International JT9174-3 solvent
Ethanol VWR International BDH67002.400 solvent
methanol VWR International BDH85681.400 solvent
pyridine VWR International BDH67007.400 solvent
2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6 Sigma Aldrich 178837 standard
C8-C24 fatty acid methyl ester Sigma Aldrich CRM18918 standard
N-methyl-N- (trimethylsilyl)trifluoroacetamide Sigma Aldrich 24589-78-4 standard
Suwanee River Fulvic Acid standard International Humic Substances Society 2S101F standard
trimethylchlorosilane Sigma Aldrich 89595 standard
Tuning Solution Agilent
FTICR-MS analysis software Bruker Compass DataAnalysis 4.1
Formularity Software Pacific Northwest National Laboratory Formularity available for download at: https://omics.pnl.gov/software/formularity
GC-MS Agilent Agilent GC 7890A with MSD 5975C
silica-based sorbent Phenomenex (Torrance, CA) Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK)
NMR TUBE 3MM 8 150 CS5 VWR International KT897820-0008 NMR tube
Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer  Varian Inova Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer
Chenomx NMR Suite 8.3 Chenomx Chenomx NMR Suite NMR software
ultra-performance liquid chromatograph  waters Aquity UPLC H  liquid chromatograph 
Velos-ETD Orbitrap mass spectrometer  ThermoFisher Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer 

References

  1. Bridgham, S. D., Megonigal, P. J., Keller, J. K., Bliss, N. B., Trettin, C. The carbon balance of North American wetlands. Wetlands. 26 (4), 889-916 (2006).
  2. Wilson, R. M., et al. Greenhouse gas balance over thaw-freeze cycles in discontinuous zone permafrost. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 122 (2), 387-404 (2017).
  3. Broder, T., Knorr, K. H., Biester, H. Changes in dissolved organic matter quality in a peatland and forest headwater stream as a function of seasonality and hydrologic conditions. Hydrology and Earth System Sciences. 21 (4), 2035-2051 (2017).
  4. Ejarque, E., et al. Quality and reactivity of dissolved organic matter in a Mediterranean river across hydrological and spatial gradients. Science of The Total Environment. 599, 1802-1812 (2017).
  5. Valenzuela, E. I., et al. Anaerobic methane oxidation driven by microbial reduction of natural organic matter in a tropical wetland. Applied and Environmental Microbiology. 83 (11), e00645-e00617 (2017).
  6. Lehmann, J., Kleber, M. The contentious nature of soil organic matter. Nature. 528 (7580), 60-68 (2015).
  7. Keiluweit, M., Nico, P. S., Kleber, M., Fendorf, S. Are oxygen limitations under recognized regulators of organic carbon turnover in upland soils?. Biogeochemistry. 127 (2-3), 157-171 (2016).
  8. LaRowe, D. E., Van Cappellen, P. Degradation of natural organic matter: A thermodynamic analysis. Geochimica et Cosmochimica Acta. 75 (8), 2030-2042 (2011).
  9. Wilson, R. M., et al. Hydrogenation of organic matter as a terminal electron sink sustains high CO2: CH4 production ratios during anaerobic decomposition. Organic Geochemistry. 112, 22-32 (2017).
  10. Ye, R., Jin, Q., Bohannan, B., Keller, J. K., Bridgham, S. D. Homoacetogenesis: A potentially underappreciated carbon pathway in peatlands. Soil Biology and Biochemistry. 68, 385-391 (2014).
  11. Neubauer, S. C., Megonigal, J. P. Moving beyond global warming potentials to quantify the climatic role of ecosystems. Ecosystems. 18 (6), 1000-1013 (2015).
  12. Ma, S., et al. Data-Constrained Projections of Methane Fluxes in a Northern Minnesota Peatland in Response to Elevated CO2 and Warming. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 122 (11), 2841-2861 (2017).
  13. Conrad, R. Contribution of hydrogen to methane production and control of hydrogen concentrations in methanogenic soils and sediments. Federation of European Microbiological Societies Microbiology Ecology. 28 (3), 193-202 (1999).
  14. Cunada, C. L., Lesack, L. F. W., Tank, S. E. Seasonal dynamics of dissolved methane in lakes of the Mackenzie Delta and the role of carbon substrate quality. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 123 (2), 591-609 (2018).
  15. Wilson, R. M., Tfaily, M. M. Advanced molecular techniques provide new rigorous tools for characterizing organic matter quality in complex systems. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 123 (6), 1790-1795 (2018).
  16. Borton, M. A., et al. Coupled laboratory and field investigations resolve microbial interactions that underpin persistence in hydraulically fractured shales. Proceedingsof the National Academy of Sciences. 115 (28), E6585-E6659 (2018).
  17. Tang, K., Page, J. S., Smith, R. D. Charge competition and the linear dynamic range of detection in electrospray ionization mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 15 (10), 1416-1423 (2004).
  18. Boiteau, R. M., et al. Structure Elucidation of Unknown Metabolites in Metabolomics by Combined NMR and MS/MS Prediction. Metabolites. 8 (1), 8 (2018).
  19. Walker, L. R., et al. Unambiguous Metabolite Identification in High-throughput Metabolomics by Hybrid 1DNMR/ESI MS Approach. Magnetic Resonance in Chemistry. 54 (12), 998-1003 (2016).
  20. Nicora, C. D., Burnum-Johnson, K. E., Nakayasu, E. S., Casey, C. P., White III, R. A., Roy Chowdhury, T., Kyle, J. E., Kim, Y. M., Smith, R. D., Metz, T. O., Jansson, J. K., Baker, E. S. The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples. J. Vis. Exp. (135), e57343 (2018).
  21. Folch, J., Lees, M., Sloane-Stanley, G. H. Extraction of fatty acid. Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).
  22. Tolic, N., et al. Formularity: software for automated formula assignment of natural and other organic matter from ultrahigh-resolution mass spectra. Analytical Chemistry. 89 (23), 12659-12665 (2017).
  23. Kim, Y. M., et al. Diel metabolomics analysis of a hot spring chlorophototrophic microbial mat leads to new hypotheses of community member metabolisms. Frontiers in microbiology. 6, 209 (2015).
  24. Hiller, K., et al. MetaboliteDetector: comprehensive analysis tool for targeted and nontargeted GC/MS based metabolome analysis. Analytical Chemistry. 81 (9), 3429-3439 (2009).
  25. Kind, T., et al. FiehnLib: mass spectral and retention index libraries for metabolomics based on quadrupole and time-of-flight gas chromatography/mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (24), 10038-10048 (2009).
  26. Kyle, J. E., et al. LIQUID: an-open source software for identifying lipids in LC-MS/MS-based lipidomics data. Bioinformatics. 33 (11), 1744-1746 (2017).
  27. Kanehisa, M. Enzyme annotation and metabolic reconstruction using KEGG. Protein Function Prediction: Methods and Protocols. 1611, 135-145 (2017).
  28. Van Krevelen, D. W. Graphical-statistical method for the study of structure and reaction processes of coal. Fuel. 29, 269-284 (1950).
  29. Hodgkins, S. B., et al. Changes in peat chemistry associated with permafrost thaw increase greenhouse gas production. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (16), 5819-5824 (2014).

Play Video

Cite This Article
Tfaily, M. M., Wilson, R. M., Brewer, H. M., Chu, R. K., Heyman, H. M., Hoyt, D. W., Kyle, J. E., Purvine, S. O. Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures. J. Vis. Exp. (143), e59035, doi:10.3791/59035 (2019).

View Video