יחיד-תפוקה משלימים שיטות אנליטיות ברזולוציה גבוהה עבור אפיון תערובות מורכבות חומר אורגני טבעי

ברחבי העולם, ביצות מוערך להכיל עמוד 529 של פחמן (C), בעיקר בתור C אורגני קבורה כבול פיקדונות¹. כיום, peatlands כזה לשמש כיור C נטו, sequestering 29 y Tg ג^-1 ב צפון אמריקה לבד¹. עם זאת, הפרעה סביבתיים כגון ניקוז, שריפות, הבצורת בטמפרטורות חם ניתן להסיט את הכיור C הזה על-ידי הגברת פירוק חומר אורגני וכתוצאה מכך הפסדים C מוגבר באמצעות גז חממה (פחמן דו-חמצני [CO₂] ו ^1,לייצור מתאן [CH₄])². שינויי אקלים עשויים לתרום הפסד C אם הטמפרטורות חם או תנאים מייבש לעורר הפירוק C מהר יותר על-ידי מיקרואורגניזמים. לחלופין, טמפרטורות גבוהות יותר אוויר CO₂ ריכוזים עשוי לעורר הייצור הראשוני לבודד CO עוד₂ בתור פחמן אורגני (OC). באיזו מידה, כמה מהר זה OC מפורקת ואז לתוך CO₂ ו- CH₄ תלוי הגומלין המורכבים בין סובסטרטים התורם של אלקטרון, הזמינות של אלקטרון acceptors המיקרואורגניזמים לתווך טרנספורמציה. במקרים רבים, המנגנונים אינם מאופיין היטב, ובכך את תגובתם לפליטת הסביבה אינה מוגבלת היטב, עדיין לא ברור מה יהיה התוצאה הסופית של שינוי האקלים על איזון פחמן peatland מערכות אקולוגיות.

האופי המורכב של חומר אורגני טבעי (NOM) הפך אפילו לזהות את תרכובות אורגניות נוכח תערובות NOM קשה מבחינה היסטורית. ההתקדמות האחרונה שיפרנו בגדול את היכולת לאפיין תרכובות באופן מסורתי זה ולהמשיך, במידה מסוימת, להיחשב הסרבן רקבובי או fulvic תרכובות^3,4,5. עכשיו הבנו כי רבים של תרכובות אלו זמינים למעשה microbially, עשוי להיות מפורקת אם מקבל אלקטרון מסוף מתאימים (תה) זמין^6,7. חישוב מצב חמצון הנומינלי של הפחמן (NOSC) עבור תרכובת מספק מדד של ניבוי הפוטנציאל הפירוק, את התשואה אנרגיה של התה הנדרש. עם זאת, זה דורש אפיון מולקולרי ברמת של חומר אורגני⁷. NOSC מחושבת על פי נוסחה מולקולרית באמצעות המשוואה הבאה⁷: NOSC = − ((−z + 4(#C) + (#H) − − 3(#N) 2(#O) + 5(#P) − 2(#S)) / (#C)) + 4, כאשר z הוא המטען נטו. NOSC הוא מתואם עם תרמודינמי נהיגה כוח⁸, שבו תרכובות עם NOSC גבוהה יותר קלים לבזות, בעוד תרכובות עם NOSC נמוך יותר דורשים יותר ויותר אנרגטיים תה כדי להיות מופחת. מתחמים עם NOSC פחות −2 דורשים אנרגיה גבוהה מניבים תה כגון O₂, חנקתי או Mn^הרביעי, לא יכול להיות מושפל על ידי המתרחשים בדרך כלל נמוך אנרגיה מניבים תה כגון Fe^השלישי או חומצה גופרתית⁷. זהו שיקול חשוב בתנאים אנאוקסיים רטוב נמצאו מקווי מים בהם O₂ ואנרגיה גבוהה אחרים מניבים תה נדיר⁹ , ולכן הם ההשפלה של תרכובות NOSC התחתון בתנאים האלה למה מוגבלת. פרטורבציה סביבתיים יכולים להשפיע על ה תרמודינמי של המערכת האקולוגית באמצעות הידרולוגיה שינויים המשפיעים על O₂ (הכי אנרגטית אלקטרון מקבל), שינויים מצעים אורגני אלקטרון acceptors זמין על-ידי ראשי הפקה, ולא במידה קטנה יותר על ידי טמפרטורה. דוגמה חשובה של ההשפעות טמפרטורה במערכות המלחות מתרחשת לגבי החלופה המתרחשת בין homoacetogenesis (קרי, אצטט הפקה של CO₂ ו- H₂) hydrogenotrophic methanogenesis ( כלומר, CH₄ הפקה של CO₂ ו- H₂). בטמפרטורות נמוכות נראה ש-homoacetogenesis הזה הוא מעט המועדף, בעוד בטמפרטורות חם יותר טובה CH₄ ייצור¹⁰. אפקט זה טמפרטורה שיש השלכות חשובות על התגובה של מערכות אקולוגיות לשינוי האקלים, כמו CH₄ הוא גז חממה הרבה יותר חזק מאשר CO₂¹¹ ובכך הגדלת הייצור של CH₄ -חשבון של CO₂ בטמפרטורות חם עשויים לתרום משוב חיובי עם התחממות האקלים.

Peatlands מייצרים כמויות משמעותיות באופן גלובלי של CO₂ , CH₄⁶באמצעות נשימה מיקרובית של באופן טבעי אורגני משנה. NOSC של סובסטרטים פחמן אורגני קביעת חלקם היחסי של CO₂: CH₄ המיוצר אשר הוא פרמטר קריטי בגלל גבוה יותר קרינה לאלץ CH₄ בהשוואה ל- CO₂¹¹, אלא גם בגלל מידול המאמצים זיהו את היחס הזה כפרמטר קריטי עבור הערכת השטף C peatlands¹². בהיעדרו של אלקטרון מסוף acceptors חוץ CO₂, ניתן להראות על ידי אלקטרון איזון כי מצעים אורגני C עם NOSC > 0 רצון לייצר CO₂: CH₄ > 1, C אורגני עם NOSC = 0 יוצרת CO₂ ו- CH₄ יחס equimolar, ו C אורגני עם NOSC < 1 יפיק CO₂: CH-₄ -< 1-¹³. פירוק של OC ב הטבעיות מתווך על ידי מיקרואורגניזמים, כך גם כאשר השפלה של מתחם מסוים הוא למה ריאלי, זה kinetically מוגבל על ידי הפעילות של אנזימים מיקרוביאלי, בתנאים אנאוקסיים, מאת תרמודינמי הדוחף (קרי, NOSC)⁷. עד עכשיו זה מאתגר לאפיין באופן מלא את החומר האורגני כי המגוון של תרכובות דורשת טכניקות שונות משלימים עבור האפיון שלהם. התפתחויות אחרונות יש סגר את הפער; באמצעות חבילת בשיטות אנליטיות אנחנו ניתן לנתח את מגוון רחב של תרכובות אורגניות מתן אפיון מולקולרי ברמת, כימות מקרים מסוימים, של מטבוליטים ראשי קטן כמו גלוקוז עד 800 Da פולי-heterocycles. בעבר מולקולות מורכבות גדולים כאלה כבר שאפיינו פשוט כמו כמו ליגנין או דמוי טאנין, בדוי כדי להיות עקשניים. אפיון מולקולרי ברמת, עם זאת, מאפשר חישוב NOSC עבור מולקולות מורכבות גדולה אפילו אלה. ערכים אלה NOSC הן באופן ליניארי בקורלציה עם הכוח המניע תרמודינמי ומאפשר הערכה של איכות חומר אורגני זמין עבור פירוק, אשר במקרים רבים מגלה כי מולקולות מורכבות אלה עשוי למעשה להיות microbially מתכלה אפילו בתנאים אנאוקסיים הקיימות בביצות.

מאז כניסתה של O₂ מאפשר חומר אורגני של כמעט כל הערכים NOSC נצפתה באופן טבעי להיות מפורקת, במסמך זה אנו מתמקדים השינויים חומר אורגני ו פרוטאומיקס חיידקים אשר צפויים להיות הנהגים ראשי בביצות (קרי, O מוגבל₂) מערכות. עם זאת, כל הטכניקות שבהן נדון ניתן ליישם חומר אורגני של כל המערכת האקולוגית. בדרך כלל, בצובר מדדים המבוססים על אופטי, ניתוחים פלורסצנטיות שימשו להערכת חומר אורגני איכותי^3,14. בעת שימוש בצובר מדידות כאלה, עם זאת, הפרטים אינם נשמרים כפי מספר רב של מולקולות מסווגים יחד בתנאים כלליים כמו humics או fulvics. ההגדרות של קטגוריות אלה אינם מוגבל היטב והם, למעשה, עשויים להשתנות אפשרי מחקר כדי לימוד ביצוע השוואות. עוד, מדידות בצובר לא לספק הפירוט מולקולרית הדרושים לחישוב את התרמודינמיקה המסדירים את המערכת, ולכן נופל קצר באמת הערכת איכות חומר אורגני¹⁵.

טכניקות בודדים כגון פורייה להפוך יון ציקלוטרון תהודה ספקטרומטר מסה (FTICR-MS), תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ספקטרוסקופיה, גז כרומטוגרפיה המוני מסות (GC-MS) ולבצע כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטר מסה (LC-MS) לספק בכזה פירוט ברמה המולקולרית. בעוד כל אחת מהטכניקות הללו מציג את מגבלותיה, הם הביאו את נקודות החוזק שלהם זה ניתן למנף בגישה משולבת כדי להשיג את הפרטים מולקולרית בסדר הכרחי עבור לכימות איכות חומר אורגני במובן תרמודינמי קפדני . GC-MS שימושית לזיהוי מטבוליטים קטן קריטי כי צפויים proximal השפעה על CO₂ ו- CH₄ הייצור (למשל, גלוקוז, אצטט, וכו ‘); עם זאת, GC-MS דורש אימות מול תקן ולכן מוגבלת תרכובות ידועות כבר קיים במסד הנתונים מונע זיהוי של תרכובות הרומן. יתר על כן, GC-MS היא טכניקה למחצה איכותי המאפשר הסקה על השינויים בריכוזים יחסית, אבל לא מספק בפועל ריכוז המידע הדרוש לחישוב חינם אנרגיות של גיב לדוגמה. לבסוף GC-MS דורש derivatization של מולקולות לפני ניתוח אשר מגביל את הרזולוציה כדי תרכובות קטן מ- Da ~ 400, כהלים נדיף אובדים במהלך השלב ייבוש.

חד-ממדי (1 ד) ¹H למצב נוזלי NMR מאפשרת אפיון כמותי מאוד קטנה מטבוליטים (לרבות מטבוליטים העיקרי משקל מולקולרי קטן שיכללו חומרים נדיפים כמו כהלים, אצטט, אצטון, formate, פירובט, succinate, כבל קצר חומצות שומן, כמו גם מגוון של פחמימות לשמצה נעדר או פרוץ מפעולות שירות מבוססי MS) ריכוזים שלהם הם שימושיים במיוחד לצורך חישוב פרמטרים תרמודינמי. ובכל זאת, כמו GC-MS, 1 י NMR של תערובות מורכבים דורש תקינה יחסית מסד נתונים, ולכן לא לבד לאפשר זיהוי קל של תרכובות הרומן כי צפויים להיות בשפע מורכבות מערכות אקולוגיות טבעיות ומשתנה. בנוסף, NMR רגיש פחות מאשר טכניקות מבוססות MS. לכן, יצירת פרופילים המטבוליט כמותיים מושגת רק מעל 1 מיקרומטר באמצעות NMR מערכות מצויד מקורר הליום קר-הגששים. NMR קצת קר-הגששים מוערך לא נרחב, מלח-סובלניים ולאפשר ניתוח הסביבה תערובת בנוכחות ריכוזי מלח millimolar בשימוש קטנים בקוטר (הקוטר החיצוני < 3 מ מ) מדגם צינורות¹⁶. עם זאת, זה סיבוך נוסף של NMR כמויות גבוהות של מתכות פאראמגנטיים ומינרלים (למשל, Fe ו- Mn מעל % wt 1-3), אשר יכול להיות שופע בקרקעות בתוליים, ניתן להרחיב תכונות ספקטרליות, לסבך את הפרשנות של ספקטרום NMR . באמצעות מיצוי מעבדתי (SPE) ניתן עוזרו של פרשנות של NMR והן מבוססות MS מטבולומיקס בשיטות על-ידי הפחתת מלחים מינרליים והגברת איכות ספקטרלי.

FTICR-MS על ידי הזרקה ישירה היא טכניקה רגישה מאוד מסוגלת לאתר עשרות אלפי מטבוליטים של דוגמה אחת, אבל זה לא ללכוד מטבוליטים קטן קריטיים כגון אצטט, פירובט succinate והוא שקשה לחסלם השתמש עבור סוכרים, פחמימות אחרות¹⁷, ואינה מספקת מידע כמותי. אולם, בניגוד טכניקות אחרות, FTICR-MS מצטיין זיהוי והקצאת נוסחה מולקולרית תרכובות הרומן, ולכן מזהה את המספר הגדול ביותר של תרכובות מתן מידע מולקולריות יותר מאשר בכל אחת מהטכניקות שתואר אחרים. דבר זה שימושי, כי המידע מולקולרית FTICR-MS (וטכניקות אחרות) יכול לשמש כדי לחשב את NOSC הקשורה הכוח המניע תרמודינמי המסדירים את הסבירות של תגובות מסוימות⁸ והתעריפים שלהם תחת מסוימים תנאים⁷. יתר על כן, על ידי צימוד FTICR-MS עם טכניקות הפרדה, כגון LC יחד עם טנדם MS, כמותיים מבניים בר השגה, קיזוז חלק מהחסרונות של טכניקה זו. LC-MS שימושית לזיהוי חומרים דמויי השומנים, אחרים מטבוליטים שאינם מאופיין היטב על ידי כל אחד השיטות האחרות. צימוד LC FTICR-MS או LC-MS עם שברים של אלמונים מסוימים עניין הבהרה מבנית של אספן שבר ואיסוף דו-ממדית (2D) נוזלי המדינה ש-NMR הוא המצב האידיאלי בזיהוי וכימות לא ידוע תרכובות^{18 ,19}. עם זאת, זהו צעד שצורכת שיכול לשמש אם וכאשר הדרושים. לקחו בנפרד, כל אחת מהטכניקות הללו מספקים תמונה שונה של החומר האורגני, על ידי שילוב אותם, נוכל להשיג הבנה מלאה יותר מאשר שימוש בכל אחת מהטכניקות בבידוד.

בעוד השיקולים תרמודינמי להגדיר את האילוצים האולטימטיבי איזה העתקות אפשריים במערכת, פירוק חומר אורגני מתווך על ידי מיקרואורגניזמים שפעילותם אנזים לשלוט שיעורי התגובה. לכן, אני מבין הפקדים פירוק חומר אורגני ובסופו של דבר החממה הפקת גז (CO₂ ו- CH₄) מן הביצות דורש גישה משולבת טכנולוגיות אפיון פעילות האנזים מיקרוביאלית כמו גם המטבוליטים. במאמר זה, אנו מתארים שיטה להשגת ניתוח מקיף של דוגמה אחת שימוש בגישה סדרתית שתוצאתו ניתוח מלא לזווג. גישה זו מרחיבה על מטבוליט, חלבונים, שומנים בדם החילוץ (MPLex) פרוטוקול שבו פרוטאומיקס היה בשילוב עם GC-MS ו- LC-MS²⁰ כדי לזהות קטנה מטבוליטים, חלבונים ושומנים על-ידי שילוב מידע כמותי מטבוליט ויה NMR וזיהוי של גדול מטבוליטים משניים ויה FTICR-גב’ מעט שונה MPLex, אנו מתחילים את הפרוטוקול עם שאיבת מים, ואז השתמש החילוץ רציפים עם ממיסים יותר ויותר לא קוטביים. כל עקירות נעשות על מדגם יחיד אשר חוסך לדוגמה כאשר אמצעי אחסון מוגבל או קשה להשיג, הקטנת השגיאה ניסיוני הציג דרך וריאציה בין aliquots מ מדגם הטרוגנית מטריצות (למשל, אדמה, כבול) או ההבדלים בין תנאי אחסון ומשך.

לבסוף, על-ידי התאמת הניתוחים אום עם פרוטאומיקס ניתוחים של הקהילה מיקרוביאלי, נוכל לבנות רשתות מטבוליות המתארים את המסלולים ואת הפיכתו של פירוק חומר אורגני. זה מאפשר לנו לבדוק היפותזות ספציפיות על איך תשפיע לפליטת למערכת CO האולטימטיבי₂ ו- CH₄ ייצור באמצעות שינוי של מצעים אורגני זמין, אלקטרון acceptors של הקהילות מיקרוביאלי בתיווכן של תגובות באמצעות הפעילות של אנזימים מזרזים.

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לספק תפוקה יחיד פרוטוקול לניתוח מטבוליטים, שומנים, חלבונים מיקרוביאלי מתוך מדגם יחיד ובכך יוצר dataset לזווג מלא לבניית רשתות מטבוליות תוך הגבלת משגיאות אנליטיות .