Summary

Single-Durchsatz ergänzende hochauflösende Analysetechniken für die Charakterisierung von komplexen natürlichen organischen Substanz Mischungen

Published: January 07, 2019
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Summary

Dieses Protokoll beschreibt einen einzigen Durchsatz für ergänzende analytische und Omics Techniken, die ihren Höhepunkt in einer voll gepaart Charakterisierung von natürlichen organischen Stoffen und mikrobielle Proteomics in verschiedenen Ökosystemen. Dieser Ansatz ermöglicht die robuste Vergleiche zur Identifizierung von Stoffwechselwegen und Transformationen für Treibhausgasproduktion Beschreibung und Vorhersage Reaktionen auf Veränderungen der Umwelt wichtig.

Abstract

Natürliche organischer Substanz (NOM) besteht aus eine hochkomplexe Mischung aus Tausenden von organischen Verbindungen, die in der Vergangenheit zur Charakterisierung schwierig erwiesen. Jedoch gekoppelt um die thermodynamischen und kinetischen Steuerelemente auf (Kohlendioxid [CO2] und [CH4] Methan) Treibhausgasproduktion infolge der Zersetzung des NOM zu verstehen, eine Charakterisierung molekularer Ebene mit mikrobiellen Proteom-Analyse ist notwendig. Darüber hinaus sollen Klima- und Umweltveränderungen natürlicher Ökosysteme, potenziell stören komplexe Interaktionen, die Einfluss auf die Versorgung mit organischer Substrate und die Mikroorganismen die Transformationen durchführen, lassen. Eine detaillierte molekulare Charakterisierung der organischen Substanz, mikrobielle Proteomics und die Wege und Transformationen, die durch die organischer Substanz zersetzt ist werden die Richtung und das Ausmaß der Auswirkungen von Veränderungen der Umwelt vorherzusagen. Dieser Artikel beschreibt einen methodischen Durchsatz für umfassende Metabolit Charakterisierung in einer einzigen Probe durch direkte Injektion Fourier Transform Ion Zyklotron Resonanz Massenspektrometrie (FTICR-MS), Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) Kernresonanzspektroskopie (NMR), Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) und Proteomics Analysen. Das Ergebnis ist ein vollständig gepaart Dataset, das verbessert die statistische Zuverlässigkeit für Wege der Abbau organischer Materie, die sich daraus ergebenden CO2 und CH4 Produktionsraten und ihre Antworten auf ökologische Störung ableiten. Hier präsentieren wir die Ergebnisse der Anwendung dieser Methode auf NOM Proben aus Mooren; das Protokoll ist jedoch für jede NOM-Probe (z. B. Torf, bewaldeten Böden, marinen Sedimenten, etc.).

Introduction

Weltweit sind Feuchtgebiete schätzungsweise 529 Pg Kohlenstoff (C), enthalten meist als organischen C in Torf Einlagen1begraben. Derzeit wirken solche Mooren als Netto C Senke, Sequestrierung 29 Tg C y-1 in Nordamerika allein1. Jedoch kann ökologische Störungen wie Entwässerung, Brände, Dürre und wärmeren Temperaturen diese C-Senke durch Erhöhung der Abbau organischer Materie, was zu erhöhten C Verluste über Treibhausgas aufgehoben (Kohlendioxid [CO2] und [CH-4] Methan) Produktion1,2. Klimawandel kann zu C beitragen, wenn wärmere Temperaturen oder trockener Bedingungen schneller C Zersetzung durch Mikroorganismen stimuliert. Alternativ können höhere Temperaturen und Luftkonzentrationen CO2 Primärproduktion um mehr CO2 als organischem Kohlenstoff (OC) absondern stimulieren. In welchem Umfang und wie schnell diese OC ist dann zerlegt in CO2 und CH4 hängt die komplexen Wechselwirkungen zwischen Elektron Spender Substrate, die Verfügbarkeit von Elektronen-Akzeptoren und die Mikroorganismen, die vermitteln die Diese Transformation. In vielen Fällen die Mechanismen sind nicht gut charakterisierten, damit ihre Reaktion auf ökologische Störungen ist nicht gut eingeschränkt und es bleibt unklar, was das Ergebnis des Klimawandels auf die Kohlenstoffbilanz in Mooren Ökosysteme.

Die komplexe Natur der natürlichen organischen Substanz (NOM) hat sogar die organischen Verbindungen im NOM Mischungen historisch schwierig zu identifizieren. Die jüngsten Fortschritte haben unsere Fähigkeit, Verbindungen, traditionell zu charakterisieren und zu einem gewissen Grad als widerspenstige Huminsäuren oder Fulvinsäuren Verbindungen3,4,5angesehen werden, weiterhin verbessert. Wir verstehen jetzt, dass viele dieser Verbindungen eigentlich mikrobiell verfügbar sind und zerlegt werden, können wenn eine geeignete terminal Elektronen-Akzeptor (Tee) zur Verfügung6,7 erfolgt. Berechnung der nominellen Oxidationsstufe des Kohlenstoffs (NOSC) für eine Verbindung bietet eine Metrik für die Vorhersage des Potenzials für die Zersetzung und die Energieausbeute des Tees erforderlich. Es erfordert jedoch eine Charakterisierung molekularer Ebene der organischen Substanz7. NOSC errechnet sich aus der Summenformel über die folgende Gleichung7: NOSC = − ((−z + 4(#C) + (#H) − 3(#N) − 2(#O) + 5(#P) − 2(#S)) / (#C)) + 4, wo z der Nettoladung ist. NOSC korreliert mit der thermodynamischen treibende Kraft8, wobei Verbindungen mit höheren NOSC leichter sind zu verschlechtern, während Verbindungen mit niedriger NOSC bedürfen zu ihrer zunehmend energetische Tees reduziert werden. Verbindungen mit weniger als −2 NOSC erfordern eine hohe Energie Gewinnung Tees wie O2, Nitrat oder MnIV, und kann nicht abgebaut werden, durch die häufig auftretenden niedriger Energie Gewinnung Teesorten wie FeIII oder Sulfat-7. Dies ist ein wichtiger Aspekt in den aufgeweichten anoxischen Bedingungen in Feuchtgebiete, wo O2 und andere hochenergetische nachgeben Tees knapp9 sind und deshalb der Abbau von niedrigeren NOSC Verbindungen unter diesen Bedingungen thermodynamisch begrenzt. Ökologische Störung beeinflussen den thermodynamischen Zustand des Ökosystems durch hydrologische Veränderungen, die Einfluss auf O2 (die energiereichsten Elektronen-Akzeptor), Veränderungen der organischen Substraten und Elektronen-Akzeptoren zur Verfügung gestellt, von primären Produktion, und in geringerem Maße von der Temperatur. Ein wichtiges Beispiel für die Temperatureffekte in Feuchtgebieten Systemen tritt in Bezug auf die Trade-off zwischen Homoacetogenesis (d.h., Acetat-Produktion von CO2 und H2) und Hydrogenotrophic () Methanogenese tritt d. h., CH4 Produktion von CO2 und H2). Bei niedrigen Temperaturen scheint es, dass Homoacetogenesis etwas begünstigt wird, während wärmere Temperaturen CH4 Produktion10bevorzugen. Diese Temperatur kann wichtige Implikationen für die Reaktion von Ökosystemen zu wechselnden Klima, wirken wie CH4 Treibhausgas ist viel stärker als CO211 und damit Steigerung der Produktion von CH4 auf Kosten des CO2 bei wärmeren Temperaturen kann auf ein positives Feedback mit Erwärmung des Klimas beitragen.

Mooren produzieren weltweit bedeutende Mengen von CO2 und CH46über mikrobielle Atmung von natürlich vorkommendem organische Materie. Die NOSC der organischen Kohlenstoff Substrate bestimmt den relativen Anteil der CO2: CH4 hergestellt, was ein kritischer Parameter aufgrund der höheren Strahlungsantriebs CH4 im Vergleich zu CO211, sondern auch, weil Modellierung Bemühungen haben dieses Verhältnis als ein kritischer Parameter für die Schätzung der C Flussmittel in Mooren12identifiziert. In Abwesenheit von terminal Elektronen Akzeptoren als CO2, es kann durch Elektron Balance gezeigt werden, dass Bio C Substrate mit NOSC > 0 wird CO-2produzieren: CH4 > 1, Bio C mit NOSC = 0 produziert CO2 und CH4 in äquimolaren Verhältnis und Bio C mit NOSC erzeugt < 1 CO2: CH4 < 113. Zersetzung von OC in natürlichen Ökosystemen wird durch Mikroorganismen, vermittelt, so dass auch beim Abbau eines bestimmten Stoffes thermodynamisch möglich ist, es kinetisch durch die Aktivität der mikrobiellen Enzyme und unter anoxischen Bedingungen von begrenzt ist die thermodynamische Antriebskraft (d.h.NOSC)7. Bis jetzt hat es schwierig, um die organische Substanz vollständig zu charakterisieren, da die Vielfalt der Verbindungen, die verschiedenen komplementäre Techniken für deren Charakterisierung erfordert. Die jüngsten Fortschritte haben die Lücke geschlossen; mit einer Suite von analytischen Techniken können wir eine Vielzahl von organischen Verbindungen, die Bereitstellung von Charakterisierung molekularer Ebene und in einigen Fällen Quantifizierung von kleinen primären Metaboliten wie Glukose bis zu 800 Da Poly-Heterozyklen analysieren. Zuvor würde so große komplexe Moleküle einfach als Lignin-ähnliche oder Tannin-Like und angenommenen widerspenstigen gewesen zu sein geprägt haben. Charakterisierung der molekularen Ebene, ermöglicht jedoch die Berechnung der NOSC für selbst diese große komplexe Moleküle. Diese NOSC Werte sind linear korreliert mit der thermodynamischen Motor ermöglicht eine Beurteilung der Qualität von organischem Material zur Zersetzung, die in vielen Fällen zeigt, dass diese komplexe Moleküle tatsächlich mikrobiell sein kann abbaubare auch unter anoxischen Bedingungen, die in den Feuchtgebieten herrschen.

Seit Einführung von O2 organischen Substanz von fast allen natürlich NOSC Beobachtungswerte zerlegt werden kann, konzentrieren hier wir uns auf Veränderungen in der organischen Substanz und mikrobielle Proteomics Haupttreiber im Feuchtgebiet (d. h., sein dürften begrenzte O2) Systeme. Jedoch können die Techniken, die wir besprechen auf organischer Substanz aus jedem Ökosystem angewendet werden. Allgemein, Bulk Messungen basierend auf optischen und Fluoreszenz-Analysen wurden verwendet, um organische Substanz Qualität3,14zu beurteilen. Bei der Verwendung von Bulk-Messungen wie diese sind feine Details verloren wie die große Zahl von Molekülen zusammen unter Oberbegriffe wie Humics oder Fulvics kategorisiert werden. Die Definitionen dieser Kategorien sind nicht gut eingeschränkt und in der Tat variieren von Studie zu Studie machen Vergleiche unmöglich. Weiter, Bulk-Messungen nicht die molekularen Details zur Berechnung der Thermodynamik für das System und daher wirklich Beurteilung organischer Qualität15zurückbleiben.

Einzeltechniken wie Fourier transformieren Ion Cyclotron Resonance Massenspektrometrie (FTICR-MS), Kernresonanzspektroskopie (NMR), Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) und Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) tun Geben Sie die Details solcher molekularer Ebene. Während jede dieser Techniken seine eigenen Grenzen präsentiert, bringen sie auch ihre eigenen Stärken, die in einem integrierten Ansatz zu molekularen Details zur Quantifizierung organischer Qualität in einem rigorosen thermodynamischen Sinne notwendig genutzt werden können . GC-MS ist nützlich zur Identifikation von kritischen kleine Metaboliten, die voraussichtlich proximalen Einfluss auf CO2 und CH4 Produktion (z. B.Glukose, Acetat, etc.); jedoch, GC-MS erfordert Überprüfung gegen einen Standard und beschränkt sich daher auf bereits bekannte Verbindungen, die in der Datenbank, die Identifizierung der neuartige Substanzen zu verhindern. GC-MS ist eine semi-qualitative Technik erlaubt Rückschlüsse über die Veränderungen im relativen Konzentrationen, aber nicht der Information tatsächliche Konzentration notwendig für die Berechnung der Gibb freie Energien zum Beispiel. Zu guter Letzt GC-MS erfordert Derivatisierung von Molekülen vor der Analyse die Auflösung kleiner als ~ 400 Da Verbindungen begrenzt und flüchtige Alkohole sind verloren während der Trocknung.

Eindimensionale (1D) 1H flüssigen Zustand NMR ermöglicht hoch quantitative Charakterisierung der kleinen Metaboliten (einschließlich primäre kleines Molekulargewicht Metaboliten und flüchtigen Stoffen wie Alkohole, Acetat, Aceton, Formiat, Pyruvat, Succinat, kurzkettige Fettsäuren, sowie eine Reihe von Kohlenhydraten notorisch abwesend oder gefährdete aus MS-basierte Methoden) und deren Konzentrationen sind besonders nützlich für die Berechnung der thermodynamischen Parameter. Doch wie GC-MS, 1D NMR von komplexen Gemischen erfordert Standardisierung im Vergleich zu einer Datenbank und daher nicht allein erlauben einfache Identifizierung von neuartigen Verbindungen, die reich an komplexen Natur- und veränderten Ökosysteme sein dürften. Darüber hinaus NMR ist unempfindlicher als die MS-basierte Techniken und Profilierung quantitative Metabolit daher erst ab 1 µM mit NMR-Systeme ausgestattet mit Helium gekühlt Kälte-Sonden erreicht ist. Nicht weithin geschätzt, einige NMR Kälte-Sonden sind salztoleranten und ökologischen Mischung Analyse im Beisein von millimolaren Salzkonzentrationen bei Verwendung in kleineren Durchmesser (< 3 mm Außendurchmesser) Probe Rohre16ermöglichen. Eine weitere Komplikation der NMR ist jedoch, dass hohe Mengen an paramagnetischen Metalle und Mineralien (z.B.Fe und Mn über 1-3 wt %(), die reichlich in Hochland Böden lässt, können spektrale Funktionen zu erweitern und erschweren die Interpretation von NMR-Spektren . Mit Festphasenextraktion (SPE) können Hilfe bei der Interpretation von NMR und MS-basierte Metabolomik Methoden durch die Verringerung der Mineralsalze und spektrale Qualitätssteigerung.

FTICR-MS durch direkte Injektion ist eine hochsensible Technik in der Lage, Zehntausende von Metaboliten aus einer einzigen Probe zu erkennen, aber es erfasst nicht die kritische kleine Metaboliten wie Acetat, Pyruvat und Succinat und ist notorisch schwierig zu Verwenden Sie für Zucker und andere Kohlenhydrate17, noch enthält es quantitative Angaben. Jedoch im Gegensatz zu den anderen Techniken FTICR-MS zeichnet sich bei identifizieren und neuartige Substanzen Molekulare Formel zuweisen und somit die größte Anzahl an Verbindungen mehr molekularen Informationen als alle anderen beschriebenen Techniken identifiziert. Dies ist nützlich, weil die molekularen Informationen FTICR-MS (und andere Techniken) verwendet werden kann, um NOSC zu berechnen, bezogen auf die thermodynamische Antriebskraft für die Wahrscheinlichkeit, dass bestimmte Reaktionen8 und ihre Preise unter bestimmten Bedingungen-7. Darüber hinaus kann durch die Kopplung von FTICR-MS mit Trennverfahren, wie z. B. LC zusammen mit Tandem MS, quantitative Strukturinformationen erreicht werden versetzen einige der Nachteile dieser Technik. LC-MS ist nützlich zur Identifikation von Lipid-ähnliche Verbindungen und andere Metaboliten, die nicht gut zeichnen sich durch eine der anderen Methoden. Kupplung FTICR LC-MS oder LC-MS mit Fraktionssammler und sammeln von Bruchteilen von bestimmten unbekannten von Interesse für strukturelle Aufklärung durch zweidimensionale (2D) flüssigen Zustand NMR ist die ideale Situation für die Identifizierung und Quantifizierung der unbekannte Verbindungen18 ,19. Dies ist jedoch eine sehr zeitaufwendige Schritt, der verwendet werden könnte, bei Bedarf. Einzeln genommen, jede dieser Techniken bieten eine andere Momentaufnahme der organischen Substanz und von zu integrieren, können wir ein vollständigeres Verständnis als die Verwendung einer der Techniken isoliert.

Während die thermodynamischen Überlegungen die ultimative Einschränkungen stellen für welche Transformationen in einem System möglich sind, ist Abbau organischer Materie durch Mikroorganismen vermittelt, deren Enzymaktivitäten Reaktionsgeschwindigkeiten steuern. Vollständig zu verstehen, die Steuerelemente am Abbau organischer Materie und letztlich (CO2 und CH4) Treibhausgasproduktion aus Feuchtgebieten erfordert daher einen integrierte Omics Ansatz zur Charakterisierung mikrobieller Enzymaktivitäten sowie die Metaboliten. In diesem Artikel beschreiben wir eine Methode zur Erreichung einer umfassenden Analysis von einer einzigen Probe mit einem sequentiellen Ansatz, der eine vollständig gekoppelte Analyse führt. Dieser Ansatz baut auf der Metabolit, Protein und Lipid-Extraktion (MPLex)-Protokoll in der Proteomik mit GC-MS und LC-MS20 kleine Metaboliten, Proteinen und Lipiden zu identifizieren, durch die Einbeziehung quantitativer Metabolit Informationen gekoppelt war über NMR und Identifizierung von größeren Sekundärmetaboliten über FTICR-Frau etwas anders, MPLex, beginnen wir das Protokoll mit einem Wasserextraktion und dann Verwendung sequentielle Extraktion mit zunehmend unpolaren Lösungsmitteln. Alle Extraktionen erfolgen auf einer einzigen Probe die Probe konserviert, wenn Volumen begrenzt oder schwer zu beschaffen sind und experimentellen Fehler eingeführt durch Unterschiede zwischen den Aliquoten aus heterogenen Stichprobe Matrizen (z.B., Erde und Torf) verringert oder Unterschiede in der Lagerbedingungen und Dauer.

Schließlich können wir durch die Kopplung der OM-Analysen mit Proteomics Analysen der mikrobiellen Gemeinschaft, metabolische Netzwerke aufbauen, die die Wege und die Transformation der Abbau organischer Materie zu beschreiben. Dies ermöglicht uns, testen Sie spezifische Hypothesen, wie Störungen des Systems ultimative CO2 und CH4 Produktion durch Änderung der vorhandenen organischen Substrate, Elektronen-Akzeptoren und mikrobiellen Gemeinschaften beeinflussen wird Vermittlung der Reaktionen über die Aktivität des Enzymkatalysatoren.

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, ein einzelnes Durchsatz-Protokoll zur Verfügung stellen für die Analyse von Metaboliten, Lipide und mikrobielle Proteine aus einer einzigen Probe, wodurch eine vollständig gekoppelte Dataset für metabolische Netzwerke aufzubauen, während analytische Fehler einschränken .

Protocol

(1) sequentielle Extraktion der organischen Substanz aus Boden, Sediment oder Torf Sammeln Sie Boden, Sedimente oder Torf über Kernbohrungen und teilen Sie Kerne nach der Hypothese getestet (z.B. Tiefe). Shop-Proben im Polytetrafluorethylen beschichtet Container und Einfrieren bei-80 ° C Lagerung vor der Analyse.Hinweis: Ca. 25 mg C ist für dieses Protokoll benötigt. Für Torf (in der Regel 45 % C) ist 50 mg von getrockneten Torf erforderlich. Größere Probenmengen können für niedri…

Representative Results

Wir die beschriebenen ergänzenden Analyse-Protokoll durchgeführt und verglichen Torf mit Tiefe im S1 Moor in der Fichte und Mooren Antwort unter wechselnden Umgebungen (Fichte) Website in Minnesota, USA. Diese Ergebnisse sind im Vergleich zu denen aus dem Permafrost Moor und Fen aus Nordschweden zu zeigen, wie Websites in Metaboliten und Enzym-Aktivitäten variieren können. Wir identifizierten 3.312 Enzyme in der Proteomik-Analyse. Eine Analyse der Aktivitäten der Enzyme mit Tiefe zeigt, dass die Anzahl der Enzyme sc…

Discussion

Der Single-Durchsatz bietet voll-gekoppelte Analyse Bach Metaboliten und das Proteom zu charakterisieren Einblicke in die Wege, durch welche, die c Radfahren in ein komplexes Ökosystem stattfindet. Boden und Torf sind heterogene Matrizen, und daher einer der kritischen Schritte dieser Methode tritt in die ersten Schritte um sicherzustellen, dass der Start Torf oder Bodenmaterial sehr homogen ist. Es empfiehlt sich, die Probe Schleifen sowie Aggregate Extraktionseffizienz reduzieren können. Dies ist ein besonderes Probl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir möchten J.P. Chanton, j.e. Kostka und M.M. Kolton danken für Unterstützung mit Torf Proben. Teile dieser Arbeit wurden an den molekularen Wissenschaften Umweltlabor, eine DOE Büro der Wissenschaft Benutzer Einrichtung vom Büro des biologischen und Umweltforschung durchgeführt. Battelle für DOE unter Vertrag DE AC05 76RL01830 PNNL gesteuert. Diese Arbeit wurde vom U.S. Department of Energy, Office of Science und Büro der biologische und ökologische Forschung unterstützt (gewährt: DE-AC05-00OR22725, DE-SC0004632, DESC0010580, DE SC0012088 und DE-SC0014416).

Materials

methoxyamine hydrochloride Sigma Aldrich 226904 derivitization agent
5 mm triple resonance salt-tolerant cold probe  Bruker instrumentation
capillary GC column HP-5MS column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) Agilent AG19091S-433 instrumentation
reversed phase charged surface hybrid column (3.0 mm × 150 mm × 1.7 μm particle size) ThermoFisher instrumentation
2 mL glass vials VWR International 46610-722 sample vials
autosampler vials VWR International 97055-324; 9467671 sample vials
Chloroform VWR International JT9174-3 solvent
Ethanol VWR International BDH67002.400 solvent
methanol VWR International BDH85681.400 solvent
pyridine VWR International BDH67007.400 solvent
2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6 Sigma Aldrich 178837 standard
C8-C24 fatty acid methyl ester Sigma Aldrich CRM18918 standard
N-methyl-N- (trimethylsilyl)trifluoroacetamide Sigma Aldrich 24589-78-4 standard
Suwanee River Fulvic Acid standard International Humic Substances Society 2S101F standard
trimethylchlorosilane Sigma Aldrich 89595 standard
Tuning Solution Agilent
FTICR-MS analysis software Bruker Compass DataAnalysis 4.1
Formularity Software Pacific Northwest National Laboratory Formularity available for download at: https://omics.pnl.gov/software/formularity
GC-MS Agilent Agilent GC 7890A with MSD 5975C
silica-based sorbent Phenomenex (Torrance, CA) Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK)
NMR TUBE 3MM 8 150 CS5 VWR International KT897820-0008 NMR tube
Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer  Varian Inova Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer
Chenomx NMR Suite 8.3 Chenomx Chenomx NMR Suite NMR software
ultra-performance liquid chromatograph  waters Aquity UPLC H  liquid chromatograph 
Velos-ETD Orbitrap mass spectrometer  ThermoFisher Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer 

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Tfaily, M. M., Wilson, R. M., Brewer, H. M., Chu, R. K., Heyman, H. M., Hoyt, D. W., Kyle, J. E., Purvine, S. O. Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures. J. Vis. Exp. (143), e59035, doi:10.3791/59035 (2019).

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