Valutazione dell'integrità del DNA di cellule staminali per la terapia cellulare cardiaca
Summary
Qui, forniamo una descrizione dettagliata di un apparato sperimentale per un’analisi della valutazione dell’integrità del DNA nelle cellule staminali prima del trapianto di cellule.
Abstract
Cellule staminali e derivati da cellule staminali hanno un potenziale immenso come terapia rigenerativa per varie malattie degenerative. Il DNA è il magazzino dei dati genetici in tutte le cellule, comprese le cellule staminali, e la sua integrità è fondamentale per la sua capacità rigenerativa. Cellule staminali subiscono rapida propagazione nei laboratori per ottenere i numeri necessari per il trapianto. Crescita accelerata delle cellule porta alla perdita di integrità del DNA dai metaboliti accumulati, come reattive dell’ossigeno, del carbonilico e agenti alchilanti. Trapianto di queste cellule porterebbe a scarso attecchimento e rigenerazione dell’organo deterioramento. Inoltre, trapiantando cellule con DNA danneggiato porta a mutazioni, instabilità del DNA, senescenza cellulare e possibilmente, life-threatening malattie come il cancro. Di conseguenza, c’è un’esigenza immediata di un metodo di controllo di qualità valutare l’idoneità della cella per il trapianto. Qui, forniamo dettagliate protocolli per la valutazione dell’integrità del DNA delle cellule staminali prima del trapianto di cellule.
Introduction
La prova sperimentale e clinica dimostra che il trapianto di cellule moderatamente può migliorare le prestazioni contrattile del ventricolo sinistro della mancata cuori1,2,3,4,5 ,6,7,8,9. Recenti progressi hanno aperto ulteriormente accattivante opportunità per rigenerazione cardiovascolare; Questi includono l’espressione forzata di fattori di riprogrammazione di cellule somatiche per indurre pluripotenza e differenziare queste cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) in diversi lignaggi cardiache, soprattutto del cardiomyocyte (CM)10, 11 , 12 , 13. il materiale ereditario in ogni cellula, compresi i iPSCs generata artificialmente e CM iPSC-derivato (iPS-CM), è il DNA. Le istruzioni genetiche memorizzate nel DNA determina la crescita, lo sviluppo e funzione di cellule, tessuti, organi e organismi. Il DNA non è inerte; metaboliti, come reattivi dell’ossigeno carbonilico e specie dell’azoto, di cella e gli agenti d’alchilazione può DNA causa danni in vitro e in vivo14,15,16,17. D’importanza, il danno del DNA si verifica in modo intuitivo in ogni cellula, con una frequenza significativa. Se questi danni non sono corretti, che porterà a mutazione del DNA, senescenza cellulare, la perdita di integrità del DNA e delle cellule e possibilmente, malattie, compreso i cancri mortali. Quindi, mantenendo l’integrità del DNA è essenziale per qualsiasi cella, soprattutto iPSCs, che ha un enorme potenziale nella clinica.
Per valutare la quantità e l’integrità del DNA genomico isolato, costose attrezzature sono disponibile sul mercato. Tuttavia, non ci sono nessun metodi semplici ed economici per valutare l’integrità del DNA in cellule senza isolare le cellule. Inoltre, utente-indotta di degradazione del DNA durante l’isolamento del DNA è uno dei principali svantaggi nell’uso di questi metodi. Le singole cellule gel elettroforesi (noto come analisi della cometa)18,19 e γH2A.X immunolabeling8 tecniche sono approcci fondamentali nei laboratori di ricerca per valutare il danno del DNA. Questi due metodi non richiedono attrezzature costose o isolato il DNA di genomic per analizzare DNA integrità8,20,21. Da allora, queste tecniche sono state effettuate con cellule intere; degradazione di DNA/RNA/proteina indotta da utente durante la preparazione del campione non influiranno questi protocolli. Qui, per valutare il danno del DNA e la risposta al danno al DNA in cellule staminali e derivati da cellule staminali, forniamo dettagliati protocolli per eseguire sia il comet assay e γH2A.X immunolabeling. Inoltre, la combinazione di questi due approcci, proponiamo una valutazione ingenuo che può essere utilizzata per valutare l’idoneità della cella per il trapianto.
Il test della cometa, o cella singola elettroforesi del gel, misura le rotture del DNA nelle cellule. Incorporato in basso punto di fusione dell’agarosi le cellule vengono lisate per nucleoids modulo contenente DNA supercoiled. All’elettroforesi, piccoli pezzi di DNA frammentato e filamenti di DNA rotti migrano attraverso i pori di agarosio, considerando che il DNA intatto, a causa della loro enorme dimensione e la loro coniugazione con la proteina della matrice, avrà una migrazione con restrizioni. Il modello di DNA macchiato con un microscopio a fluorescenza imita una cometa. La testa di cometa contiene DNA intatto e la coda è composta da frammenti e rotta filamenti di DNA. La frazione di danno del DNA può essere misurata con l’intensità di fluorescenza del DNA danneggiato (coda della cometa) riguardante l’intensità di (testa di cometa) DNA intatto. Il momento di coda di parametro può essere calcolato come illustrato nella Figura 1.
Danno al DNA induce la fosforilazione dell’istone H2A. X (γH2A.X) a Ser139 da chinasi ATM, ATR e DNA-PK. La fosforilazione e l’assunzione di H2A. X alle rotture del filo del DNA si chiama risposta al danno al DNA (DDR) e avviene rapidamente dopo il DNA è danneggiato. A seguito di questo processo, arresto del ciclo cellulare di checkpoint-mediata e DNA vengono avviati processi di riparazione. Dopo il completamento della riparazione del DNA, γH2A.X è defosforilata e inattivato da fosfatasi. Prolungata e più rotture del filo del DNA portano all’accumulo di γH2A.X i fuochi nel DNA. Questo indica l’incapacità delle cellule di riparare il danno del DNA e la perdita di integrità del DNA. Questi focolai γH2A.X nel DNA possono essere identificati da e il numero dei fuochi DDR può essere contato utilizzando il protocollo nella sezione 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Integrità del DNA ritrae l’integrità delle cellule. Cellule con DNA danneggiato sono frequentemente nello sforzo e alla fine perdono la loro integrità. L’integrità delle cellule staminali e derivati da cellule staminali che sono essere propagate ai fini del trapianto è principale per le cellule di svolgere la loro funzione desiderata. Trapianto di cellule con DNA danneggiato avrebbe provocato un tasso di attecchimento poveri e prestazioni della cella8,20. Di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato in parte dal National Heart, Lung e sangue Istituto sovvenzioni RO1-HL-99507, HL-114120, HL-131017, HL138023 e UO1-HL-134764 (a Zhang J.) e dall’American Heart Association scientifico Development Grant 17SDG33670677 (di R. Michel).
Materials
| 0.25% Trypsin | Corning | 25200056 | |
| 8-well chamber slide | Millicell | PEZGS0816 | |
| Accutase | Stemcell Technologies | 7920 | Cell detachment solution |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG |
Jackson Immuno Research Laboratories |
711-545-152 (RRID: AB_2313584) |
|
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories |
711-165-152 (RRID:AB_2307443) |
|
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| Gibco B-27 Supplement, Serum Free, | Gibco | 17504-044 | |
| Matrigel growth factor reduced | Corning | 354230 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| PhalloidinA488 | Life Technology | A12379 | |
| Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody | Cell Signaling Technology | 2577 (RRID: AB_2118010) | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| SYBR Green I nucleic acid gel stain | Sigma-Aldrich | S9430 | |
| Triton X-100 | Fisher scientific | BP151-100 | |
| UltraPure Low melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade |
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