Kardiyak hücre tedavisi için kök hücre DNA bütünlük değerlendirilmesi
Summary
Burada, bir analiz DNA bütünlük içinde kök hücre hücre transplantasyonu önce değerlendirme için deneysel bir kurulumuna ilişkin ayrıntılı bir açıklama sağlamak.
Abstract
Kök ve kök hücre kaynaklı hücreler çeşitli dejeneratif hastalıklar için yenileyici bir terapi olarak büyük potansiyele sahip. DNA’sı, kök hücre de dahil olmak üzere tüm hücrelerdeki genetik veri depo ve bütünlüğünü rejeneratif kabiliyetini temelini oluşturur. Kök hücre nakli için gerekli numaraları elde laboratuvarlarında hızlı yayılma tabi. Hızlandırılmış hücre büyümesini reaktif oksijen, karbonil ve alkilleyici gibi birikmiş metabolitleri tarafından DNA bütünlük kaybına yol açar. Bu hücrelerin nakli zavallı engraftment ve rejenerasyon bozulan organ neden olur. Ayrıca, DNA zarar görmüş hücreleri yol açan mutasyonlar, DNA istikrarsızlık, hücresel yaşlanma dikim ve muhtemelen, hayatı tehdit edici hastalıkları kanser gibi. Bu nedenle, hücrenin uygunluğu nakli için değerlendirmek bir kalite kontrol yöntemi acilen ihtiyaç vardır. Burada, kök hücre hücre transplantasyonu önce DNA bütünlüğünü değerlendirilmesi için adım adım iletişim kuralları sağlar.
Introduction
Deneysel ve klinik kanıt hücre transplantasyonu orta hearts1,2,3,4,5 başarısız sol ventrikül contractile performansı artırabilir gösterir ,6,7,8,9. Son gelişmeler daha da çekici kardiyovasküler rejenerasyon için fırsatlar açtı; Bunlar somatik hücre Nanog teşvik ve bu indüklenmiş pluripotent kök hücreler (IPSC) farklı kalp soy, önemlisi cardiomyocyte (CM)10, ayırt etmek için programlama faktörlerin zorla ifade dahil 11 , 12 , 13. DNA yapay olarak oluşturulan iPSCs ve IPSC kaynaklı CM (IPS-CM), dahil olmak üzere her hücredeki kalıtsal malzemedir. DNA içinde depolanan genetik yönergeleri belirler büyüme, gelişme ve işlevi hücreler, dokular, organlar ve organizmalar. DNA etkisiz değil; metabolitleri, reaktif oksijen, karbonil ve azot türleri, gibi hücre ve alkilleyici neden DNA tüp bebek ve içinde vivo14,15,16,17zarar verebilir. Önemlisi, DNA hasarı sezgisel olarak önemli bir frekans ile her hücre oluşur. Bu zararlar düzeltilmez ise, bu DNA mutasyon, hücresel yaşlanma, DNA ve hücre bütünlüğü ve muhtemelen, hastalıklar, yaşamı tehdit eden kanser de dahil olmak üzere kaybına yol açacaktır. Bu nedenle, DNA bütünlüğünü koruyarak herhangi bir hücreye, özellikle klinikte çok büyük potansiyele sahip iPSCs, esastır.
Miktar ve izole genomik DNA bütünlüğünü değerlendirmek için pahalı aletler piyasada mevcuttur. Ancak, hücreleri izole olmadan hücrelerdeki DNA bütünlüğünü değerlendirmek için hiçbir basit ve maliyet-etkin yöntem vardır. Ayrıca, Kullanıcı kaynaklı DNA yıkımı sırasında DNA izolasyon Bu yöntemler kullanarak büyük dezavantaj biridir. Tek hücreli jel elektroforez (kuyruklu yıldız tahlil olarak da bilinir)18,19 ve γH2A.X immunolabeling8 araştırma laboratuarları ve DNA hasarı değerlendirmek için temel yaklaşımlar tekniklerdir. Bu iki yöntem pahalı ekipman veya DNA bütünlük8,20,21analiz etmek izole genomik DNA gerektirmez. Beri bu teknikleri içeren bütün hücreleri gerçekleştirilmiş; Kullanıcı kaynaklı DNA/RNA/protein yıkımı numune hazırlama sırasında bu iletişim kuralları etkilemez. Burada, DNA hasarı ve DNA hasarı yanıt kök ve kök hücre kaynaklı hücreler olarak değerlendirmek için kuyruklu yıldız tahlil ve γH2A.X immunolabeling gerçekleştirmek için adım adım protokolleri sağlamak. Ayrıca, bu iki yaklaşım birleştirerek, biz nakli için hücrenin uygunluğu değerlendirmek için kullanılan bir saf değerlendirme öneriyorum.
Kuyruklu yıldız tahlil veya tek hücre Elektroforez jel, hücrelerdeki DNA sonları ölçer. Düşük erime özel katıştırılmış hücreleri supercoiled DNA içeren formu nucleoids lysed. Bozulmamış DNA, onların büyük boyutu ve onların konjugasyon matris protein nedeniyle kısıtlı bir geçiş olacak ise Elektroforez özel gözenekler parçalanmış DNA ve kırık DNA iplikçikleri küçük parçalar geçirin. Bir floresan mikroskop altında lekeli DNA modeli taklit eden bir kuyruklu yıldız. Kuyruklu yıldız baş bozulmamış DNA içerir ve kuyruk parçaları oluşur ve kırık DNA dizilerini. DNA hasarı kısmını hasarlı DNA (kuyruklu yıldız kuyruk) Floresan yoğunluğu tarafından bozulmamış DNA (kuyruklu yıldız başı) yoğunluk göreli olarak ölçülebilir. Parametre kuyruk an Şekil 1‘ de gösterildiği gibi hesaplanabilir.
DNA hasarı fosforilasyon histon H2A nın neden olmaktadır. X (γH2A.X) Ser139 ATM, ATR ve DNA-PK kinazlar tarafından. Fosforilasyon ve H2A alımı. DNA kırılmalara X DNA hasarı yanıt (DDR) denir ve DNA hasar sonra hızla olur. Bu işlem, denetim noktası-aracılı hücre döngüsü tutuklama ve DNA onarım işlemleri başlatılır. DNA onarım başarıyla tamamlayan γH2A.X dephosphorylated ve fosfatazlar tarafından inaktive olur. Uzun süreli ve DNA ‘ γH2A.X foci birikimi için birden fazla DNA kırılmalara yol. Bu hücrenin DNA hasarı ve DNA bütünlüğü kaybı onarmak yetersizlik gösterir. DNA’daki bu γH2A.X foci belirlenebilir ve DDR foci sayısı 2 bölümünde iletişim kuralını kullanarak sayılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA bütünlük hücre bütünlük canlandırıyor. Hücreler hasarlı DNA ile sık sık stres vardır ve sonunda kendi bütünlüğünü kaybetmek. Kök ve nakli amacıyla yayılır kök hücre kaynaklı hücreler hücreleri onların istenen işlevi gerçekleştirmek asıl dürüstlüktür. Hasarlı DNA içeren hücrelerin nakli bir zavallı engraftment hızı ve performansı cep8,20neden olacaktır. Bu nedenle, hücre transplantasyonu önce DNA bütünlük ince…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser kısmen Ulusal Kalp, akciğer ve kan Enstitüsü hibe RO1-HL-99507, tarafından desteklenmiştir HL-114120, HL-131017, HL138023 ve UO1-HL-134764 (için J. Zhang) ve Amerikan Kalp Derneği bilimsel gelişme Grant 17SDG33670677 (için R. Kannappan) tarafından.
Materials
| 0.25% Trypsin | Corning | 25200056 | |
| 8-well chamber slide | Millicell | PEZGS0816 | |
| Accutase | Stemcell Technologies | 7920 | Cell detachment solution |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG |
Jackson Immuno Research Laboratories |
711-545-152 (RRID: AB_2313584) |
|
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories |
711-165-152 (RRID:AB_2307443) |
|
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| Gibco B-27 Supplement, Serum Free, | Gibco | 17504-044 | |
| Matrigel growth factor reduced | Corning | 354230 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| PhalloidinA488 | Life Technology | A12379 | |
| Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody | Cell Signaling Technology | 2577 (RRID: AB_2118010) | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| SYBR Green I nucleic acid gel stain | Sigma-Aldrich | S9430 | |
| Triton X-100 | Fisher scientific | BP151-100 | |
| UltraPure Low melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade |
References
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
- Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
- Tomita, Y., et al. Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart. Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).
- Oyama, T., et al. Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo. Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).
- Fischer, K. M., et al. Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase. Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).
- Cottage, C. T., et al. Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase. Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).
- Angert, D., et al. Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells. Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).
- Kannappan, R., et al. p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo. EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).
- Hatzistergos, K. E., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation. Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).
- Okita, K., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).
- Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Zhang, L., et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast. Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).
- Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals. Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).
- Martinez, G. R., et al. Oxidative and alkylating damage in DNA. Mutation Research. 544 (2-3), 115-127 (2003).
- Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chemico-Biological Interactions. 160 (1), 1-40 (2006).
- Wiseman, H., Halliwell, B. Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer. Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 123 (1), 291-298 (1984).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).
- Goichberg, P., et al. Age-associated defects in EphA2 signaling impair the migration of human cardiac progenitor cells. Circulation. 128 (20), 2211-2223 (2013).
- Kannappan, R., Mattapally, S., Wagle, P. A., Zhang, J. Transactivation domain of p53 regulates DNA repair and integrity in human iPS cells. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. , (2018).
- Al-Baker, E. A., Oshin, M., Hutchison, C. J., Kill, I. R. Analysis of UV-induced damage and repair in young and senescent human dermal fibroblasts using the comet assay. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (6-7), 664-672 (2005).
- Azqueta, A., Gutzkow, K. B., Brunborg, G., Collins, A. R. Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions. Mutation Research. 724 (1-2), 41-45 (2011).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).
- Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state. Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).
