Beurteilung Stem Cell DNA-Integrität für kardiale Zelltherapie
Summary
Hier bieten wir eine ausführliche Beschreibung des Versuchsaufbaus für eine Analyse der Bewertung der DNA-Integrität in Stammzellen vor Stammzelltransplantation.
Abstract
Stiel und Stamm-abgeleitete Zellen haben immenses Potential als regenerative Therapie für verschiedene degenerative Krankheiten. DNA ist das Lagerhaus genetischer Daten in allen Zellen, einschließlich Stammzellen, und seine Integrität ist grundlegend für seine Regenerationsfähigkeit. Stammzellen werden schnelle Ausbreitung in Labors, die notwendigen Zahlen für die Transplantation zu erreichen. Beschleunigte Zellwachstum führt zum Verlust der DNA-Integrität durch angesammelte Stoffwechselprodukte wie reaktive Sauerstoff, Carbonyl und Alkylantien Agenten. Transplantation dieser Zellen führt zu schlechten Engraftment und Regeneration der sich verschlechternden Orgel. Darüber hinaus Umpflanzen DNA beschädigt Zellen führt zu Mutationen, DNA-Instabilität, zelluläre Seneszenz und möglicherweise lebensbedrohliche Krankheiten wie Krebs. Daher ist eine unmittelbare Notwendigkeit für eine Qualitätskontrollmethode, um die Zelle Eignung für Transplantationen zu bewerten. Hier bieten wir detaillierte Protokolle für die Beurteilung der DNA-Integrität der Stammzellen vor Stammzelltransplantation.
Introduction
Experimentelle und klinische Beweise zeigt, dass Zelltransplantation gemäßigt linken Ventrikel kontraktilen Ermangelung Herzen1,2,3,4,5 verbessern können ,6,7,8,9. Die jüngsten Fortschritte haben eröffnet weitere attraktive Möglichkeiten für kardiovaskuläre Regeneration; Dazu gehören die erzwungene Expression Neuprogrammierung Faktoren in somatischen Zellen induzieren Pluripotenz und differenzieren diese induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) in verschiedenen kardialen Linien, vor allem Cardiomyocyte (CM)10, 11 , 12 , 13. das Erbgut in jeder Zelle, einschließlich der künstlich erzeugten iPSCs und iPSC-abgeleitete CM (iPS-CM), ist die DNA. Die genetischen Anweisungen, die in der DNA gespeicherten diktiert die Wachstum, Entwicklung und Funktion von Zellen, Geweben, Organen und Organismen. DNA ist nicht träge; Handy-Metaboliten, wie reaktive Sauerstoff, Carbonyl und Stickstoff-Spezies, und Alkylantien Agenten kann Ursache Schäden an DNA in vitro und in-vivo-14,15,16,17. DNA-Schäden tritt vor allem intuitiv in jeder Zelle mit einer erheblichen Frequenz. Wenn diese Schäden nicht behoben sind, wird es zu DNA-Mutation, zelluläre Seneszenz, den Verlust der DNA und Zelle Integrität und gegebenenfalls Krankheiten, einschließlich lebensbedrohlichen Krebserkrankungen führen. Daher ist es wichtig, jede Zelle, besonders iPSCs, das enormes Potenzial in der Klinik hat, DNA-Integrität beizubehalten.
Für die Bewertung der Menge und der Integrität der isolierte genomische DNA, ist die teure Ausrüstung auf dem Markt verfügbar. Allerdings gibt es keine einfachen und kostengünstigen Methoden, um die Integrität der DNA in den Zellen zu beurteilen, ohne die Zellen zu isolieren. Benutzer-induzierten DNA-Abbau während der DNA-Isolierung ist übrigens einer der größten Nachteile im Umgang mit diesen Methoden. Die einzellige Gel-Elektrophorese (bekannt als Comet Assay)18,19 und γH2A.X Immunolabeling8 Techniken sind grundlegende Ansätze in Forschungslabors zur Bewertung von DNA-Schäden. Diese beiden Methoden benötigen keine teure Ausrüstung oder isolierte genomische DNA, DNA-Integrität8,20,21zu analysieren. Seitdem wurden diese Techniken mit ganzer Zellen durchgeführt; Benutzer-induzierten DNA/RNA/Proteinabbau während der Probenvorbereitung wird keine Auswirkungen auf diese Protokolle. Hier, um die DNA-Schäden und DNA-Schäden Antwort in Stamm und Stamm-abgeleitete Zellen zu beurteilen, bieten wir Ihnen Schritt für Schritt-Protokolle, um die Comet-Assay und γH2A.X der Immunolabeling durchführen. Darüber hinaus schlagen verbindet diese beiden Ansätze, wir eine naiv-Bewertung, die verwendet werden kann, um die Zelle Eignung für Transplantationen zu bewerten.
Die Comet-Assay oder einzellige gel-Elektrophorese, misst die DNA-Brüchen in den Zellen. Zellen in niedrigschmelzenden Agarose eingebettet sind, Form ausgedehnt mit supercoiled DNA lysiert. Bei der Elektrophorese durchwandern kleine Stücke von fragmentierten DNA und gebrochenen DNA-Strängen die Agarose Poren, intakte DNA, aufgrund ihrer enormen Größe und ihre Konjugation mit dem Matrix-Protein, eine eingeschränkte Migration auswirken. Das Muster der gefärbten DNA unter dem Fluoreszenzmikroskop imitiert ein Komet. Der Kopf des Kometen enthält intakte DNA und die Rute besteht aus Fragmenten und gebrochen DNA-Stränge. Der Anteil der DNA-Schäden kann durch die Fluoreszenzintensität der beschädigten DNA (Kometenschweif) bezogen auf die intakte DNA (Kopf des Kometen) Intensität gemessen werden. Der Parameter Heck Moment kann berechnet werden, wie in Abbildung 1dargestellt.
DNA-Schädigung induziert die Phosphorylierung der Histone H2A. X (γH2A.X) am Ser139 von ATM, ATR und DNA-PK Kinasen. Die Phosphorylierung und Rekrutierung von H2A. X zu DNA-Strangbrüchen nennt man DNA-Schäden Antwort (DDR) und schnell geschieht, nachdem DNA beschädigt ist. Im Anschluss an diesen Prozess, Checkpoint-vermittelten Zellzyklus Festnahme und DNA-Reparaturprozesse initiiert. Nach dem erfolgreichen Abschluss der DNA-Reparatur ist γH2A.X Rezeptorsignals und durch Phosphatasen inaktiviert. Verlängert und mehrere DNA-Strangbrüchen führen zu die Ansammlung von γH2A.X Brennpunkte in der DNA. Dies zeigt die Zelle Unfähigkeit, die DNA-Schäden und dem Verlust der Integrität der DNA zu reparieren. Durch diese γH2A.X Brennpunkte in DNA identifiziert werden können und die Anzahl der DDR Brennpunkte kann unter Verwendung des Protokolls in Abschnitt 2 gezählt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA-Integrität schildert Zelle Integrität. Zellen mit beschädigter DNA sind häufig in Stress und schließlich ihre Integrität zu verlieren. Die Integrität der Stiel und Stamm-abgeleitete Zellen, die zum Zweck der Transplantation wird propagiert werden ist für die Zellen ihre gewünschte Funktion ausführen. Transplantation von Zellen mit beschädigter DNA führt zu einer schlechten Engraftment Rate und Leistung der Zelle8,20. Daher ist die Untersuchung der…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch nationale Herz-, Lungen- und Blut-Institut Stipendien RO1-HL-99507, HL-114120, HL-131017, HL138023 und UO1-HL-134764 (an J. Zhang) und durch die American Heart Association wissenschaftliche Development Grant 17SDG33670677 (zu R. Kannappan).
Materials
| 0.25% Trypsin | Corning | 25200056 | |
| 8-well chamber slide | Millicell | PEZGS0816 | |
| Accutase | Stemcell Technologies | 7920 | Cell detachment solution |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG |
Jackson Immuno Research Laboratories |
711-545-152 (RRID: AB_2313584) |
|
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories |
711-165-152 (RRID:AB_2307443) |
|
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| Gibco B-27 Supplement, Serum Free, | Gibco | 17504-044 | |
| Matrigel growth factor reduced | Corning | 354230 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| PhalloidinA488 | Life Technology | A12379 | |
| Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody | Cell Signaling Technology | 2577 (RRID: AB_2118010) | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| SYBR Green I nucleic acid gel stain | Sigma-Aldrich | S9430 | |
| Triton X-100 | Fisher scientific | BP151-100 | |
| UltraPure Low melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade |
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