Formação espontânea e rearranjo das redes de nanotubo lipídica Artificial como um modelo de baixo para cima para o retículo endoplasmático
Summary
Com suporte sólido, isento de proteína, dobro fosfolipídeo BICAMADA membranas (DLBM) podem ser transformadas em redes de nanotubo de lipídios complexos e dinâmicos e podem servir como modelos 2D de baixo para cima do retículo endoplasmático.
Abstract
Apresentamos um método conveniente para formar um modelo estrutural organela ascendente para o retículo endoplasmático (ER). O modelo consiste de nanotubos lipídico altamente densos que são, em termos de morfologia e dinâmica, uma reminiscência de ER. As redes são derivadas de patches de membrana dupla BICAMADA fosfolipídicas aderindo ao substrato transparente Al2O3 . A adesão é mediada por Ca2 + no buffer de ambiente. Subsequente depleção de Ca2 + através de BAPTA/EDTA causa retração da membrana, resultando na formação de rede de nanotubo de lipídios espontânea. O método só é composto por fosfolipídios e microfabricated superfícies simples formação de um modelo ER e não requer a adição de proteínas ou energia química (por exemplo, GTP ou ATP). Em contraste com a morfologia 3D do retículo endoplasmático celular, o modelo é bidimensional (embora o nanotubo dimensões, geometria, estrutura e dinâmica é mantida). Este modelo exclusivo em vitro ER consiste apenas de alguns componentes, é fácil de construir e pode ser observada sob um microscópio de luz. A estrutura resultante pode ser ainda mais decorada para obter funcionalidades adicionais, tais como a adição de proteínas associadas a ER ou partículas para estudar os fenômenos de transporte entre os tubos. As redes artificiais descritas aqui são modelos estruturais adequados para o celular de ER, cuja morfologia característica única mostrou estar relacionada com a sua função biológica, Considerando que detalhes sobre a formação do domínio tubular e rearranjos dentro são ainda não completamente entendidos. Notamos que esse método usa o Al2O3 lamelas microscopia fino-revestido por película, que estão comercialmente disponíveis mas exigem encomendas especiais. Portanto, é aconselhável ter acesso a uma instalação microfabrication para preparação.
Introduction
O ER executa tarefas cruciais na célula biológica, incluindo o enrolamento de proteínas, síntese de lipídios e cálcio Regulamento1,2. A morfologia do ER é intrínseca para as funções que ele executa. Ele combina pilhas planares e domínios tubulares denso-dinâmico, que continuamente interagem com o citoesqueleto e sofrem rearranjo e movimento constante. Alguns da remodelação que se submeter a estruturas ER incluem a transformação contínua entre folhas planas e tubos, formação de vesículas de ou fusão ao lúmen do ER, alongamento dos tubos pré-existentes, retração de tubo, fusão e ruptura3. A estrutura peculiar das redes tubulares é energeticamente desfavorável. Os caminhos e os mecanismos pelos quais o ER gera e mantém esta organização, bem como a forma como isso se relaciona com a sua função não é ainda totalmente compreendido4,5.
É sabido que o ER avarias quando perde seu estado homeostático, resultando em estresse de ER, uma condição causada por um aumento na síntese proteica, acúmulo de misfolded proteínas ou mudanças de Ca2 + e equilíbrio oxidativo. ER stress por sua vez provoca a deformação da morfologia natural da organela, especificamente, perturbar a organização de rede6,7. Como resposta, a célula ativa um mecanismo de reparação para retornar a um estado homeostático. Falha no reparo pode levar à apoptose celular induzida por ER, que contribui para várias doenças metabólicas e degenerativas como a doença de Alzheimer, diabetes tipo 2, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica e vários outros7, 8. Pesquisa atual visa a organização das redes tubulares ER e vários estudos estão se concentrando em reconstituir o ER em vitro2. Existindo alguns modelos2,9,10 necessitam de proteínas para iniciar e manter a membrana curvatura3,11 e ajudar a organela atingir sua forma. Claramente, os sistemas modelo que espelham alguns dos principais recursos estruturais e organizacionais do PS e fornecem acesso a avançados estudos experimentais estão em grande demanda.
Apresentamos aqui os procedimentos para a preparação de um facile, proteína química/energia livre, dinâmico em vitro modelo para o ER, fornecendo uma plataforma básica para estudar a morfologia de ER e funções associadas4. Neste método, um modelo ER é fabricado com uma abordagem de baixo para cima, usando apenas alguns elementos, em que as moléculas de interesse podem ser integradas para adicionar complexidade. A rede representa a dinâmica e a estrutura de ER. Além disso, transformação reversível entre a membrana planar e os tubos, formação de vesículas de tubos, tubo de fusão, deslizando e retração todos observam. Além de servir como um modelo de baixo para cima para o ER celular incompletamente compreendido, a rota de lipídios para redes de nanotubos descritos no presente protocolo pode ser aplicável para pesquisadores estudando auto-montagem, nanofluidics, único-molécula e coloide fenômenos de transporte, fluxo de Marangoni e outros campos relacionados. Os blocos de construção moleculares somente usados em nosso método são fosfolipídios. O protocolo exige laboratório pouco trabalho e equipamento básico e está acessível para a incorporação de elementos adicionais.
Protocol
Representative Results
Discussion
A discussão a seguir, são descritas as etapas críticas, possíveis modificações e limitações do protocolo. O primeiro passo crítico é a correcta montagem da câmara de observação, dado que a adesão do quadro PDMS à superfície Al2O3 é intrinsecamente fraca. No caso onde o quadro não adere ao substrato corretamente, o conteúdo irá vazar da câmara de observação e o experimento vai chegar a um impasse. Os principais fatores que impedem a adequada vedação da superfície e quadro são 1) a falta de limpeza completa do quadro PDMS (reutilizado) e 2) ar bolhas que ocasionalmente obter aprisionadas entre o quadro e o substrato. Deve ser usado um quadro PDMS recém preparado ou completamente limpo. O quadro deve ser lavado antes e após cada utilização com isopropanol, seguido por lavagem com água e secar com nitrogênio. As Al2O3 superfícies não requerem qualquer limpeza prévia, uma vez que eles são fabricados em um ambiente de sala limpa e mantidos em recipientes fechados até o uso. Devido a natureza anfótera da Al2O3, não devem ser exposta a soluções fortemente ácidas ou básicas. Outros projetos para a câmara de observação podem ser empregados, dependendo da acessibilidade da instalação do individual. Características importantes desta câmara são acesso gratuito para a amostra de líquido da parte superior aberta e a inércia do material quadro no que diz respeito a soluções usadas e amostras. As dimensões da Câmara também são um fator significativo, como eles devem acomodar um volume de 0,5 a 1 mL. Desde que as superfícies utilizadas são normalmente tamanho padrão lamelas (24 x 60 mm), o volume da câmara é determinado principalmente pela espessura da moldura. A nosso conhecimento, espaçadores com o tamanho e profundidade que pode acomodar os volumes de amostra normalmente tratados neste protocolo não estão disponíveis comercialmente. Por conseguinte, dedicamos uma seção no protocolo para detalhes de fabricação e montagem de um quadro de câmara de amostra.
O outro passo crítico neste protocolo é a troca de reserva. Um desafio nesta etapa é o tempo necessário para realizar esta troca. A propagação do MLV em caso de contacto com o Al2O3 substrato é instantânea, e da contínua expansão do DLBM leva à sua ruptura, encerrando o experimento (Figura 2A, B). Portanto, a divulgação deve ser constantemente monitorizada, e a troca de reserva deve ser realizada em tempo hábil. A troca não deve ser realizada muito rapidamente após a inicialização da divulgação, a fim de permitir que os patches de membrana atingir um tamanho ideal (100-200 µm de diâmetro). Por outro lado, adesão contínua na superfície faz com que tensão de membrana de alta, que leva à ruptura. Assim, a membrana todos patches eventualmente ruptura se espalhar não é interrompida. O momento da ruptura difere para cada patch, uma vez que depende do tamanho e estrutura interna do MLV e acessibilidade dos lipídeos nele. Portanto, o momento da troca deve ser providenciado para um Commit na qual os patches não-ruptura com tamanhos ideais representam a maioria da população inteira. Outro desafio na etapa de troca de amortecedor é a taxa de remoção e adição de buffers. Realizar esta substituição muito rapidamente tem uma influência prejudicial sobre as estruturas de membrana final (Figura 2C-E). A extração excessiva de Ca2 +– HEPES buffer sem deixar uma película fina de líquido sobre o substrato, resulta em manchas secas e irreversivelmente deformado de membrana (Figura 2C). Mesmo que uma quantidade adequada de líquido é mantida na superfície, adição abrupta do buffer quelante-HEPES também causa perturbação das estruturas de membrana. Figura 2 D,E mostra a aparência típica de patches de membrana direccionado rompidas. O rompimento total morfológico não necessariamente influencia as propriedades dinâmicas das estruturas finais (i.e., os rearranjos tubulares nas restantes áreas ainda irão ocorrer). No entanto, ele se tornará difícil de observar a transformação material nas estruturas deformadas. Por exemplo, na Figura 2D, seria difícil determinar a direção para a qual se retrai MLV a DLBM.
Uma eventual modificação do protocolo é a composição de lipídios utilizada. O foco principal tem sido na fosfolipídios que dominam a composição de ER em mamíferos e16 do fermento (e. g., fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE) e fosfatidilinositol (PI). Os experimentos originais foram realizados usando misturas de PC e PI4. Nos resultados apresentados, foi usadas uma mistura de PC e droga e um derivado do PE. No entanto, nem todas as composições de lipídios arbitrárias foram encontradas para criar as estruturas tubulares, obtidas através do presente protocolo. Algumas das outras misturas lipídico experimentalmente investigada envolvem extrato total coração, polar de extracto de feijão de soja, extrato de e. coli polar, misturas de PC com stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoinositol (Super-PI) em razões diferentes e misturas de PC-PE-PI-Posphatidyl serina (PS), em proporções variáveis. Desde estruturas tubulares da membrana possuem altas curvaturas e requerem um arranjo especial de moléculas lipídicas individuais, espera-se que o fenômeno observado é lipídico composição específica.
Outra modificação aplicada neste protocolo é o método para a fabricação de superfície. Aqui, o ALD foi usado para fabricar as Al2O3 revestido lamelas. Isto difere do método de deposição originalmente relatado, reativo4que sputtering. Enquanto isso indica que um método alternativo de fabricação superfície ainda pode levar a ER, como tubulation, uma limitação importante parece ser a especificidade do material superficial. O modo de propagação e a força de adesão são altamente dependentes de propriedades do material de superfície, que influenciam fatores como interações eletrostáticas, molhabilidade, hidrofobicidade e rugosidade da superfície. Al2O3 superfícies fornecem a força de adesão ideal, e filmes de lipídios podem ambos anexar fortemente o suficiente para se espalhou como uma membrana de bicamada lipídica dupla e desanexar a redes tubulares de forma após a remoção de íons de Ca2 + . Anteriormente, nós testamos o mesmo experimento com SiO2, em que as vesículas multilamellar se espalhou como uma membrana de bicamada lipídica dupla, mas sem formação de rede tubular foi observada após a adição de quelantes17. De fixação e formação do tubo são observados somente em Al2O3 ou plasma gravado Al18. Nossas investigações revelaram que o parâmetro contribuindo levando a tal fenômeno era o zeta potencial das superfícies, para que Al e Al2O3 foram perto de zero (mV) e SiO2 significativamente negativos. O potencial zeta de borosilicato é semelhante ao SiO219; Portanto, a adesão de filmes de lipídios em borosilicato é igualmente forte e irreversível. Na verdade, lipídios multilamellar reservatório de contato com superfícies de borosilicato normalmente leva a ruptura imediata e formação de único lipid bilayers20. As Al2O3 superfícies necessárias para este protocolo não são prontamente ou comercialmente disponíveis. Podem, no entanto, ser ordenada personalizada de fabricantes de vidro e o substrato de especialidade. Acesso às instalações de salas limpas com equipamento de fabricação de película fina é altamente recomendado.
Os outros métodos ascendente existentes para fabricar redes tubulares, como ER2,10 envolvem proteínas, bem como a entrada de energia química (ex., GTP e ATP). Rapoport e colegas2 relatou a formação de redes-ER vidro lamelas em vitro misturando as proteínas de membrana-flexão presentes na sala de emergência, com fosfolipídios e GTP. O trabalho de Bachand et al 10 mostra como essas redes tubulares dinâmicas podem ser criadas usando motores moleculares e ATP como fonte de energia. Este protocolo apresentado não requer proteínas de membrana ou hidrólise de compostos orgânicos para a energia. Os componentes essenciais só são o substrato sólido e os fosfolipídios. Purificação e extração de proteínas não são necessários. Este protocolo fornece, em termos de simplicidade das moléculas constitutivas, o modelo mais básico de ER.
Com este modelo básico, com base em lipídios ER estabelecido, construir a complexidade, adicionando componentes ER-associada é de interesse, uma vez que permite a investigação dos impactos individuais do sistema. Semelhante às redes ER reais, tubos no modelo são dinâmicos. A conjugação de e a migração das proteínas de membrana rotulada ou partículas fluorescentes em toda a rede tubular, podem dar informações sobre a direção do movimento da membrana. Encapsulamento e monitoramento dos líquidos dentro do DLBM e tubos fluorescentes durante a transformação e um possível mapeamento do transporte intratubular conteúdo podem servir como outro foco. Finalmente, pode adoptar-se uma transição do modelo ER 2D resultantes deste protocolo para um modelo 3D de ER suave através de encapsulamento das redes em arquiteturas de hidrogel.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos o Prof Aldo Jesorka partir da Chalmers University of Technology na Suécia por suas inestimáveis comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi tornado possível através do apoio financeiro obtido a partir da concessão do projeto de Conselho de pesquisa da Noruega (Forskningsrådet) 274433, UiO: ambiente de convergência das Ciências da vida, o Conselho Sueco de pesquisa (Vetenskapsrådet) Project Grant 2015-04561, bem como o financiamento de start-up fornecido pelo centro de Medicina Molecular Noruega & faculdade de matemática e ciências naturais na Universidade de Oslo.
Materials
| Pear-shape flask 10 mL | Lenz Laborglasinstrumente | 3.0314.13 | In which the lipid mixture is prepared |
| Hamilton 5 mL glass syringe (P/N) | Hamilton | P/N81520 | For transfer of the chloroform to beaker |
| Custom large hub needle Gauge 22 S | Hamilton | 7748-18 | Removable needle for syringe specified in row 3 |
| Hamilton 250 µL glass syringe | Hamilton | 7639-01 | Used for transfer of lipids in chloroform to the flask |
| Large hub Gauge 22 S | Hamilton | 7780-03 | Removable needle for syringe specified in row 5 |
| Hamilton 50 µL glass syringe | Hamilton | 7637-01 | Used for transfer of fluorophore-conjugated lipids to the flask |
| Small hub Gauge 22 S | Hamilton | 7770-01 | Removable needle for syringe specified in row 7 |
| Chloroform anhydrous (≥99%) | Sigma-Aldrich | 288306 | Used to complete the lipid mixture to a total of 300 µL |
| Soy L-α Phosphatidyl choline lipid (Soy PC) | Avanti Polar Lipids Inc | 441601 | phospholipid species contributing to 69% of the total composition/mixture |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids Inc | 850725 | phospholipid species contributing to 30% of the lipid composition/mixture |
| L-α Phosphatidyl inositol lipid (Soy PI) | Avanti Polar Lipids Inc | 840044 | alterative phospholipid species contributing to 30% of the lipid composition/mixture (from the original article Bilal and Gözen, Biomaterials Science, 2017) |
| Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,triethylammonium salt (Texas Red DHPE) | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | T1395MP | Fluorescent-lipid conjugate, 1% of the lipid composition/mixture |
| Digital Dry Baths/Block Heaters | Thermo Fischer | 88870006 | To warm glycerol in order to decrease its viscosity |
| Glycerol for molecular biology (≥99%) | Sigma Life Science | G5516 | For lipid preparation |
| PBS buffer (pH=7.8); ingredients below in rows 17-21 | Used to prepare the lipid suspension | ||
| TRIZMA base, primary standard and buffer (≥99%) | Sigma Life Science | T1503 | Used to prepare PBS buffer |
| Potassium phosphate tribasic, reagent grade (≥98%) (K3PO4) | Sigma-Aldrich | P5629 | PBS buffer ingredient |
| Magnesium sulfate heptahydrate, BioUltra (≥99,5%) KT (MgSO47H2O) | Sigma Life Science | 63138 | PBS buffer ingredient |
| Potassium phosphate monobasic, anhydrous, free flowing, Redi-Dri, ACS (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 795488 | PBS buffer ingredient |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate ACS reagent, 99.0-101.0% (Na2EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | PBS and Chelator-HEPES buffer ingredient |
| Ultrasonic cleaner USC-TH | VWR | 142-0084 | Ultrasonication of rehydrated lipids |
| Rotary evaporator - Büchi rotary evaporator Model R-200 | Sigma | Z626797 | For evaporation of chloroform |
| Pressure meter – Vacuum regulator IRV-100 | SMC | IRV10/20 | For controlling the pressure value during lipid dehydration |
| HEPES-buffer (pH=7.8); ingredients below in rows 26-27 | Used for rehydration of lipids. Content: 10 mM HEPES with 100 m NaCl diluted in ultrapure deionized water | ||
| HEPES ≥99.5% (titration) | Sigma Life Science | H3375 | HEPES-buffer ingredient |
| Sodium chloride for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥98% (titration) (NaCl) | Sigma Life Science | S3014 | HEPES-buffer ingredient |
| Calcium-HEPES buffer (pH=7.8); effective ingredient below in row 29 | Used for spreading of lipids. Content: 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 4 mM CaCl2 diluted in ultrapure deionized water | ||
| Calcium chloride anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0% (CaCl2) | Sigma Life Science | C5670 | To prepare Calcium-HEPES buffer |
| Chelator-HEPES buffer (pH=7.8); effective ingredient below in row 31 | Used to promote the formation of tubular networks. Content: 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA and 7 mM BAPTA diluted in ultrapure deionized water | ||
| 1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt ≥95% (HPLC) (BAPTA-Na4) | Sigma Life Science | 14513 | Chelator-HEPES buffer ingredient |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 30620 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| pH meter accumet™ AE150 pH | Fisher Scientific | 1544693 | Used to measure the pH of all buffers |
| Glass petri dish | VWR | HECH41042012 | 6 cm, used for making the PDMS sheet |
| Potassium hydroxide ACS reagent, ≥85%, pellets (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473 | To make the KOH solution for cleaning glass petri dish for the fabrication of the PDMS sheet |
| Isopropanol prima ren 99.5% | Antibac AS | 600079 | KOH solution ingredient |
| Heating and drying oven – venticell | MMM Medcenter Einrichtungen GmbH | MC000714 | For drying of the glass petri dish after silanization and to cure PDMS |
| Dichlorodimethylsilane ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 440272 | Used for silanization of glass petri dish in which PDMS sheet is prepared |
| Vacuum pump | Cole-Parmer | EW-79202-05 | Connected to desiccator |
| Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow corning | 24236-10 | Kit to make PDMS solution |
| Sylgard 184 Silicone elastomer base | |||
| Disposable scalpel | Swann-Morton | 11798343 | Used to cut the PDMS |
| Cover slips | Menzel -Gläser | MEZ102460 | 24×60 mm. Used to deposit thin film of Al2O3 |
| Atomic layer deposition system | Beneq | TFS200 (model number) | Atomic Layer deposition system used to deposit thin film of Al2O3 in microscope cover glass |
| Ellipsometer | J.A. Woollan Co. | Alpha-SE (model name) | System used to charcaterize the thickness of the film deposited on glass surface |
| Laser scanning confocal microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 X | Microscope used for visualization of the experiment |
| Objective 40x, 1.3 NA | Leica Microsystems | 1550635 | Used for visualization of the experiment |
| White light laser source | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 X | For excitation of the membrane fluorophore |
References
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