Katı destekli, protein içermeyen, Çift fosfolipid bilayer membranlar (DLBM) karmaşık ve dinamik lipid nanotüp ağlara dönüştürülebilir ve endoplazmik retikulum 2D aşağıdan yukarıya modelleri olarak hizmet verebilir.
Biz endoplazmik retikulum (ER) için bir tabandan tavana yapısal organel model oluşturmak için uygun bir yöntem mevcut. Model olan lipidik son derece yoğun nanotüpler oluşur, Morfoloji ve dinamikleri, ER anımsatan açısından. Ağlar için şeffaf bir Al2O3 substrat kalarak fosfolipid Çift Kişilik bilayer membran yamalar türetilir. Yapışma tarafından Ca2 + ortam arabellekte aracılık ettiği. Sonraki tükenmesi Ca2 + BAPTA/EDTA ile retraksiyon spontan lipid nanotüp ağ oluşumu sonucu membran, neden olur. Bu yöntem sadece fosfolipitler ve microfabricated yüzeyler için basit bir ER modeli oluşumu oluşur ve proteinler veya kimyasal enerji (Örneğin, GTP veya ATP) eklenmesi gerektirmez. De olsa (nanotüp boyutları, geometri, yapısı ve dinamikleri korunur) hücresel endoplazmik retikulum 3D morfolojisi aksine, iki boyutlu bir modeldir. Bu benzersiz vitro ER model sadece birkaç bileşenden oluşur, kolay oluşturmak ve bir ışık mikroskobunda görülebilir. Elde edilen yapısı daha da ER ilişkili proteinler veya taşıma olayları tüplerin arasında çalışmaya parçacıklar eklenmesi gibi ek işlevsellik için dekore edilebilir. Burada açıklanan yapay uygun yapısal modeller için benzersiz olan karakteristik morfoloji kanıtlanmıştır onun biyolojik işlevi için ilgili olarak ise ER, borulu etki alanı oluşumu ile ilgili detayları hücresel ağlardır ve düzenlemeler içinde hala tamamen anlaşılır. Bu yöntem hangi ticari mevcuttur ancak özel siparişler gerektirir Al2O3 ince film kaplı mikroskopi coverslips, kullandığına dikkat edin. Bu nedenle, bir microfabrication tesis hazırlanması için erişimi önerilir.
Acil servis protein katlanması, lipit sentezi ve kalsiyum yönetmelik1,2de dahil olmak üzere biyolojik hücre içinde önemli görevler gerçekleştirir. ER morfoloji gerçekleştirdiği işlevler iç. Düzlemsel yığınları ve dinamik yoğun borulu etki, sürekli sitoiskeleti ile etkileşim ve sürekli hareket ve yeniden birleştirir. Bazı ER yapıları geçmesi remodeling düzlemsel çarşaf ve tüpler, vezikül oluşumu veya ER lümen, önceden varolan Tüp, tüp geri çekilmesi, füzyon ve kırılma3uzama fusion arasında sürekli dönüştürme içerir. Kendine özgü borulu ağların enerjik olumsuz yapısıdır. Henüz tam olarak anlayamadım4,5yolları ve acil servis oluşturur ve bu işlevi için ilgili ne kadar bu kuruluş de değil tutar mekanizmaları.
Bu homeostatik durumunu, kaybettiğinde ER ER stres, protein sentezi, misfolded proteinleri birikimi artış veya Ca2 + ve oksidatif dengesi değişiklikler kaynaklanan bir durum sonuçlanan arıza bilinmektedir. ER stres sırayla deformasyon organel doğal morfolojisi özellikle ağ organizasyon6,7rahatsız edici tarafından neden olur. Cevap olarak, hücre homeostatik bir duruma döndürmek için bir onarım mekanizması etkinleştirir. Hata tamir çeşitli metabolik ve dejeneratif hastalıklar Alzheimer hastalığı, tip 2 diyabet, Parkinson hastalığı, amyotrofik lateral skleroz ve birkaç diğerleri gibi7katkı ER indüklenen hücre apoptosis için yol açabilir, 8. Mevcut araştırma borulu ER ağlar organizasyonu hedefleyen ve çeşitli çalışmalarda ER vitro2başlamaktan üzerinde duruluyor. Birkaç mevcut modelleri2,9,10 proteinler başlatmak ve membran eğriliği3,11 korumak ve organel şeklini ulaşmak yardım gerektirir. Açıkça, bazı acil servisin temel yapısal ve kuruluş özellikleri ayna ve gelişmiş deneysel çalışmalar erişim sağlamak modeli büyük talep sistemlerdir.
Burada ER Morfoloji ve ilişkili işlevler4çalışma için temel bir platform sağlayan yordamlar ER, facile, protein/kimyasal enerji içermeyen, dinamik vitro manken hazırlanması için mevcut. Bu yöntemde, bir ER modeli içinde faiz moleküllerinin karmaşıklığı eklemek için entegre edilebilir yalnızca birkaç öğeler kullanarak bir aşağıdan yukarıya yaklaşımı ile imal edilmiştir. Ağ ER yapısı ve dinamikleri temsil eder. Ayrıca, ters çevrilebilir dönüştürme düzlemsel membran ve tüplerin arasında vezikül oluşumu tüpleri, tüp füzyon, sürgülü ve retraksiyon tüm görülebilir. Eksik olarak anlaşılır hücresel ER için aşağıdan yukarıya manken olarak hizmet ek olarak lipid rota bu protokol için açıklanan nanotüp ağlara kendinden montajlı nanofluidics, tek-molekül ve kolloid eğitim araştırmacılar için geçerli olabilir taşıma olayları, Marangoni akış ve diğer ilgili alanlarda. Bizim yönteminde kullanılan sadece moleküler yapı taşları fosfolipitler vardır. Protokol küçük laboratuvar çalışma ve temel donanım gerektirir ve ek öğeleri birleşme için erişilemez.
Aşağıdaki tartışmada, kritik adımlar, olası değişiklikler ve protokol sınırlamaları anlatılmaktadır. Verilen bu PDMS çerçeve Al2O3 yüzeyine yapışma özünde zayıf ilk kritik adım Gözlem odası uygun montaj olduğunu. Durumda, nereye belgili tanımlık çerçevelemek için belgili tanımlık substrate düzgün bağlı olmayan içerik gözlem odasından sızıntısı olacak ve denemeyi durdurmak için gelecek. Uygun engel ana faktörler sızdırmazlık yüzeyi ve çerçeve 1) bir eksikliği (yeniden kullanılan) PDMS çerçevesinde temizlik ve 2) zaman zaman çerçevesi ve substrat arasında entrapped kabarcıklar. Yeni hazırlanmış veya iyice temizlenmiş PDMS çerçeve kullanılmalıdır. Çerçeve önce ve ardından DI su ile durulama ve azot ile blow-drying isopropanol ile her kullanımdan sonra durulanır. Beri bir temiz oda ortamında fabrikasyon ve kadar kullanmak kapalı kaplarda muhafaza Al2O3 yüzeyler herhangi bir önceki temizlik gerektirmez. Al2O3amphoteric doğası gereği, bu şiddetle asidik veya temel çözümler maruz değil. Gözlem odası için diğer tasarımlar, bireysel Kur Erişilebilirlik bağlı olarak istihdam edilebilir. Önemli bu odası ücretsiz erişim için sıvı örnek üstünün açık ve çerçeve malzeme kullanılan çözümler ve örnekleri ile ilgili hareketsizlik bulunuyor. Bir birimden 0,5 1 ml karşılamak gibi odası boyutları da önemli bir faktördür. Kullanılan yüzeyler genellikle standart boyutlu coverslips (24 x 60 mm) olduğundan, Odası hacmi çoğunlukla çerçevenin kalınlığı tarafından belirlenir. Bilgimizi, çubukları örnek hacmi genellikle bu protokol için ele kalabileceği derinliği ve boyutu ile ticari olarak mevcut değildir. Bu nedenle fabrikasyon ayrıntılarını ve örnek odası çerçeveyi montajı için protokol bölümünde adadık.
Bu iletişim kuralı diğer kritik bir adımda arabellek alışverişidir. Bu değişimi gerçekleştirmek için gereken zamanlama Bu adımda bir mücadeledir. MLV Al2O3 yüzey ile temas üzerine yayılıyor anlık ve DLBM sürekli genişleme-onun parçalanma için deneme (Şekil 2A, B) sonlandırma yol açar. Bu nedenle yaymak sürekli izlenmeli ve arabellek Satım zamanında yapılması gerekiyor. Değişimi çok hızlı başlatma, membran yamalar bir en uygun boyutu (çapı 100-200 µm) ulaşmak için izin vermek için yayılma sonra gerçekleştirilmesi gereken değil. Öte yandan, sürekli yapışma yüzeyi parçalanma için yol yüksek membran gerginlik neden olur. Böylece, yaymak değil kesilirse tüm membran rüptürü sonunda yamalı. Bu boyut ve MLV iç yapısını ve lipidler erişilebilirliğini orada bağlıdır beri rüptür zamanlama her yama için farklıdır. Dolayısıyla, Döviz an en uygun boyutları ile un rüptüre yamalar tüm nüfusun çoğunluğu temsil bir timepoint organize edilmelidir. Kaldırma hızı ve ek arabellek arabellek Satım adımda başka bir mücadeledir. Bu ikame çok hızlı gerçekleştirme son membran yapılar (Şekil 2C-E) zararlı bir etkisi vardır. Yüzey üzerinde ince bir sıvı film çıkmadan Ca2 +– HEPES tampon aşırı çıkarma kurutulmuş ve geri dönüşümsüz deforme membran düzeltme ekleri (Şekil 2C) ile sonuçlanır. Bile uygun bir miktar sıvı yüzeyde korunur, ani şelatör HEPES tampon eklenmesiyle pertürbasyon membran yapıları da neden olur. Resim 2 D,E hydrodynamically kesintiye membran yamalar tipik görünümünü gösterir. Genel morfolojik bozulma (kalan alanlarda borulu düzenlemeler hala ortaya çıkaryani ) son yapıların dinamik özellikler mutlaka etkilemez. Bununla birlikte, deforme yapıları üzerinde malzeme dönüştürme gözlemlemek zor olur. Örneğin, Şekil 2‘ deD, hangi doğru MLV DLBM geri çeker yönünü belirlemek zor olurdu.
Bir olası değişiklik protokolü kullanılan lipid kompozisyon olduğunu. Ana odak noktası memeliler ER bileşiminde hakim ve16 Maya fosfolipitler olmuştur (e. g., phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE) ve phosphatidylinositol (PI). PC ve PI karışımları4kullanarak özgün deneyler yapıldı. Ve sonuçları sunulan, PC ve uyuşturucu karışımı ve PE bir türevi kullanıldı. Ancak, tüm rasgele lipit kompozisyonları bu protokolü ile elde edilen yapılar oluşturmak için bulundu. Deneysel olarak incelenen lipid karışımları birkaç dahil toplam kalp özü, soya fasulye özü kutup, E. coli özü kutup, stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoinositol (Lyso-PI) değişen oranları ile PC karışımları ve karışımları PC-PE-PI-Posphatidyl serin (PS) değişen oranlarda içinde. Borulu membran yapılar yüksek eğrilikleri sahip ve bireysel lipid molekülleri özel düzenleme gerektirir beri gözlemlenen fenomen lipid kompozisyon özgü olduğunu bekleniyor.
Bu protokol için uygulanan bir başka değişiklik yüzey imalat için yöntemidir. Burada, ALD Al2O3 kaplı coverslips imal etmek kullanıldı. Bu başlangıçta bildirilen ifade yönteminden4SAÇTIRMA reaktif farklıdır. Bu bir alternatif yüzey imalat yöntemi hala ER benzeri tubulation için yol açabilir gösterirken, bir önemli sınırlama yüzey malzemesi özgüllük gibi görünüyor. Yayılma modu ve yapışma gücü yüksek yüzey malzemesi elektrostatik etkileşimler, wettability, hydrophobicity ve yüzey pürüzlülüğü faktörlere etkileyen özellikleri bağlıdır. Al2O3 yüzeyler en iyi yapışma gücü sağlamak ve lipid filmleri her ikisi de yeterince güçlü bir kişilik lipid bilayer membran yaymak ve form borulu ağlara kaldırmadan Ca2 + iyonlarının ayırmak için ekleyebilirsiniz. Daha önce aynı deneyi bir çift lipid bilayer membran multilamellar veziküller yayıldı ama hiçbir borulu ağ oluşumu şelatörlerin17eklenmesi gözlendi SiO2, test ettik. De-eki ve tüp oluşumu sadece Al2O3 üzerinde gözlenen veya plazma Al18kazınmış. Araştırmalarımız ortaya böyle bir olay için önde gelen katkıda bulunan parametre zeta vardı hangi Al ve Al2O3 idi yakın sıfır (mV) yüzeyler, potansiyel ve SiO2 önemli ölçüde olumsuz. Borosilikat zeta potansiyel SiO219‘ a benzer; Bu nedenle, yapışma borosilikat lipid filmleri aynı derecede güçlü ve tedavi edilemez olduğunu. Aslında, borosilikat yüzeyler ile multilamellar lipid depo temas genellikle hemen rüptürü ve tek lipid bilayers20oluşumuna yol açar. Bu iletişim kuralı için gerekli Al2O3 yüzeyleri kolayca veya ticari olarak mevcut değildir. Onlar ancak, özel cam ve substrat üreticilerin özel sipariş olabilir. İnce film İmalat Ekipmanları ile temiz oda tesislerine erişim şiddetle tavsiye edilir.
Varolan aşağıdan yukarıya yöntemleri ER benzeri borulu ağları2,10 imal etmek giriş kimyasal enerjinin yanı sıra protein içerir (Örn., GTP ve ATP). Rapoport ve meslektaşları2 ER-ağlar oluşumu membran bükme proteinler acil serviste, mevcut fosfolipitler ve GTP ile karıştırılarak cam coverslips vitro bildirdi. Çalışması ile Bachand vd. 10 moleküler motorlar ve ATP enerji kaynağı olarak kullanarak dinamik böyle borulu ağlar nasıl oluşturulması göstermektedir. Sunulan bu protokolü membran proteinlerinin veya organik bileşikleri hidroliz için enerji gerektirmez. Katı substrat ve fosfolipitler yalnızca temel bileşenleridir. Arıtma ve proteinler çıkarımı gerekli değildir. Bu iletişim kuralı, bünye molekülleri kolaylığı açısından en temel ER modeli sağlar.
Soruşturma sistemi bireysel etkileri sağlar beri kurulan bu temel, lipid tabanlı ER, binayı havaya karmaşıklık ER ilişkili bileşenleri ekleyerek ilgi, modelidir. Gerçek ER ağlar, model tüplerde dinamik benzer. Konjugasyon için ve etiketli membran proteinlerinin veya borulu ağ genelinde floresan parçacıklar geçiş membran hareket yönü hakkında bilgi verebilir. Saklama ve floresan sıvı DLBM ve tüpler içinde dönüşümü ve olası bir eşleme intratubular içerik taşıma sırasında izleme başka bir odak noktası olarak hizmet verebilir. Son olarak, bu iletişim kuralı bir 3D pürüzsüz ER modeli doğru kaynaklanan 2D ER modeli arasında bir geçiş hidrojel mimarileri ağlarda encapsulation yoluyla kabul edilebilir.
The authors have nothing to disclose.
Biz Prof. Aldo Jesorka Chalmers Teknik Üniversitesi İsveç’dan el yazması onun çok değerli yorumlar için teşekkür ederim. Bu eser ile finansal destek Norveç Araştırma Konseyi (Forskningsrådet) proje desteği 274433, UIO elde mümkün yapıldı: Yaşam Bilimleri yakınsama çevre, İsveçli Araştırma Konseyi (Vetenskapsrådet) projesi hibe 2015-04561, Moleküler tıp Norveç & öğretim matematik ve Doğa Bilimleri, Oslo Üniversitesi Merkezi start-up finansman sağladığı gibi.
Pear-shape flask 10 mL | Lenz Laborglasinstrumente | 3.0314.13 | In which the lipid mixture is prepared |
Hamilton 5 mL glass syringe (P/N) | Hamilton | P/N81520 | For transfer of the chloroform to beaker |
Custom large hub needle Gauge 22 S | Hamilton | 7748-18 | Removable needle for syringe specified in row 3 |
Hamilton 250 µL glass syringe | Hamilton | 7639-01 | Used for transfer of lipids in chloroform to the flask |
Large hub Gauge 22 S | Hamilton | 7780-03 | Removable needle for syringe specified in row 5 |
Hamilton 50 µL glass syringe | Hamilton | 7637-01 | Used for transfer of fluorophore-conjugated lipids to the flask |
Small hub Gauge 22 S | Hamilton | 7770-01 | Removable needle for syringe specified in row 7 |
Chloroform anhydrous (≥99%) | Sigma-Aldrich | 288306 | Used to complete the lipid mixture to a total of 300 µL |
Soy L-α Phosphatidyl choline lipid (Soy PC) | Avanti Polar Lipids Inc | 441601 | phospholipid species contributing to 69% of the total composition/mixture |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids Inc | 850725 | phospholipid species contributing to 30% of the lipid composition/mixture |
L-α Phosphatidyl inositol lipid (Soy PI) | Avanti Polar Lipids Inc | 840044 | alterative phospholipid species contributing to 30% of the lipid composition/mixture (from the original article Bilal and Gözen, Biomaterials Science, 2017) |
Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,triethylammonium salt (Texas Red DHPE) | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | T1395MP | Fluorescent-lipid conjugate, 1% of the lipid composition/mixture |
Digital Dry Baths/Block Heaters | Thermo Fischer | 88870006 | To warm glycerol in order to decrease its viscosity |
Glycerol for molecular biology (≥99%) | Sigma Life Science | G5516 | For lipid preparation |
PBS buffer (pH=7.8); ingredients below in rows 17-21 | Used to prepare the lipid suspension | ||
TRIZMA base, primary standard and buffer (≥99%) | Sigma Life Science | T1503 | Used to prepare PBS buffer |
Potassium phosphate tribasic, reagent grade (≥98%) (K3PO4) | Sigma-Aldrich | P5629 | PBS buffer ingredient |
Magnesium sulfate heptahydrate, BioUltra (≥99,5%) KT (MgSO47H2O) | Sigma Life Science | 63138 | PBS buffer ingredient |
Potassium phosphate monobasic, anhydrous, free flowing, Redi-Dri, ACS (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 795488 | PBS buffer ingredient |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate ACS reagent, 99.0-101.0% (Na2EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | PBS and Chelator-HEPES buffer ingredient |
Ultrasonic cleaner USC-TH | VWR | 142-0084 | Ultrasonication of rehydrated lipids |
Rotary evaporator - Büchi rotary evaporator Model R-200 | Sigma | Z626797 | For evaporation of chloroform |
Pressure meter – Vacuum regulator IRV-100 | SMC | IRV10/20 | For controlling the pressure value during lipid dehydration |
HEPES-buffer (pH=7.8); ingredients below in rows 26-27 | Used for rehydration of lipids. Content: 10 mM HEPES with 100 m NaCl diluted in ultrapure deionized water | ||
HEPES ≥99.5% (titration) | Sigma Life Science | H3375 | HEPES-buffer ingredient |
Sodium chloride for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥98% (titration) (NaCl) | Sigma Life Science | S3014 | HEPES-buffer ingredient |
Calcium-HEPES buffer (pH=7.8); effective ingredient below in row 29 | Used for spreading of lipids. Content: 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 4 mM CaCl2 diluted in ultrapure deionized water | ||
Calcium chloride anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0% (CaCl2) | Sigma Life Science | C5670 | To prepare Calcium-HEPES buffer |
Chelator-HEPES buffer (pH=7.8); effective ingredient below in row 31 | Used to promote the formation of tubular networks. Content: 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA and 7 mM BAPTA diluted in ultrapure deionized water | ||
1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt ≥95% (HPLC) (BAPTA-Na4) | Sigma Life Science | 14513 | Chelator-HEPES buffer ingredient |
Sodium Hydroxide | Sigma | 30620 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
pH meter accumet™ AE150 pH | Fisher Scientific | 1544693 | Used to measure the pH of all buffers |
Glass petri dish | VWR | HECH41042012 | 6 cm, used for making the PDMS sheet |
Potassium hydroxide ACS reagent, ≥85%, pellets (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473 | To make the KOH solution for cleaning glass petri dish for the fabrication of the PDMS sheet |
Isopropanol prima ren 99.5% | Antibac AS | 600079 | KOH solution ingredient |
Heating and drying oven – venticell | MMM Medcenter Einrichtungen GmbH | MC000714 | For drying of the glass petri dish after silanization and to cure PDMS |
Dichlorodimethylsilane ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 440272 | Used for silanization of glass petri dish in which PDMS sheet is prepared |
Vacuum pump | Cole-Parmer | EW-79202-05 | Connected to desiccator |
Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow corning | 24236-10 | Kit to make PDMS solution |
Sylgard 184 Silicone elastomer base | |||
Disposable scalpel | Swann-Morton | 11798343 | Used to cut the PDMS |
Cover slips | Menzel -Gläser | MEZ102460 | 24×60 mm. Used to deposit thin film of Al2O3 |
Atomic layer deposition system | Beneq | TFS200 (model number) | Atomic Layer deposition system used to deposit thin film of Al2O3 in microscope cover glass |
Ellipsometer | J.A. Woollan Co. | Alpha-SE (model name) | System used to charcaterize the thickness of the film deposited on glass surface |
Laser scanning confocal microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 X | Microscope used for visualization of the experiment |
Objective 40x, 1.3 NA | Leica Microsystems | 1550635 | Used for visualization of the experiment |
White light laser source | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 X | For excitation of the membrane fluorophore |