自発的な形成と小胞体のボトムアップ モデル人工脂質ナノチューブ ネットワークの転位

1. リン脂質小胞懸濁液の準備 注: すべての材料のために「クリーン」このプロトコル徹底的にイソプロパノール続いて脱イオン水で洗浄し、窒素とブロードライに呼ぶ。通常固体基板上への脂質膜の準備のプロトコルに適用される、強く酸化酸性剤 (ピラニア溶液) とガラス基板の治療を Al2O3を実行しないように注意してください-コーティングキャリア。 クリーン 10 mL 丸底または反転の洋ナシ形のガラス フラスコ内の場所: [例えばテキサス赤 1, 2 – 選択の脂質共役分子蛍光、1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (麻薬、30%/w)、ホスファチジルコリン (PC, 69%/w) 大豆 L αdihexadecanoyl sn グリセロホスファチジン 3 phosphoethanolamine triethylammonium 塩 (TR DHPE、1%/w)] クロロホルム;最終濃度 10 mg/mL のクロロホルムを 300 μ l 添加の脂質の 3000 μ g 合計量。注: ガラス、ポリテトラフルオロ エチレン プランジャー クロロホルムを含む化合物を処理するときとガス タイトな注射器を使用、クリーン。注意: クロロホルムは有毒で揮発性の高いと関連付けられた個人保護具のヒューム フードの下で常に処理する必要があります。 ロータリーエバポレーター、45 ° の傾きで位置にフラスコを接続し 24 rpm に減らされた空気圧で 6 時間の 23 ° c の水浴中でゆっくりと回転させるし、クロロホルムを完全に削除します。20 kPa (150 Torr、80% 真空) に到達するまで、20 kPa 2 分ごとの手順で回転を開始した後の圧力権利を減らすことを開始します。注: 調製容器に均一な厚さの均質な脂質膜の形成は、rotavap プロシージャの最も重要な要件です。脂質製剤は、回転速度、急激な圧力の変化と、最終的な圧力値に敏感したがって、必ず終了圧力と回転速度と同様、遅い削減の手順を従ってください。脂質脱水ケーキがフラスコの壁に映画として均等に形成されることを保証するための 45 ° のチルトをフラスコを位置します。回転の速すぎて乱れ回転の遅いしリードは (重力) フラスコ下部流体の厚い層の蓄積につながります。プロセス、非常に不均一脂質を膨潤後一晩中量産が最終的な超音波処理の手順にも応答しないし、結果の分数は、組成の異なる。圧力とメソッドで指定した範囲内の時間は、ゆっくり脱溶媒を保証します。クロロホルム溶媒として、あまりにも圧力の低下の急速な冷却粘度上昇および骨材と不均一な膜の形成に終って混合物。6 時間の長い期間は水分補給に脂質材料に有機溶剤のパーティションとして、可能な限りに溶媒を除去するためにお勧めします。 6 h 後回転を停止、20 kPa 100 kPa に達するまで 2 分ごとの手順で再度、徐々 に空気圧を高めます。フラスコを回転蒸発器から外し、3 mL の PBS とグリセリンの 30 μ L を追加します。グリセロールを溶解するため、フラスコを軽く旋回します。脂質を含むフラスコを密封するのに気密ガラス ストッパーを使用します。注: グリセロール脂質膜の完全な脱水を防ぐために使用され、二層分離12を有効に。それは、この化合物の処理が容易になりますその粘度が低下する使用する前に加熱する必要があります。PBS バッファー温めたグリセリンはまだすぐにミックスします。グリセロールを完全に溶解するまで穏やかな旋回が必要です。 4 ° c 脂質膜の腫れや水分補給のため一晩冷蔵庫にフラスコを格納します。 次の日に制服、わずかに濁った脂質懸濁液を達成するまで超音波水浴室温 (RT、~ 21 ° C)、35 kHz の周波数を持つ脂質超音波を照射します。メモ: 超音波処理周りかかる 10-30 s. 長時間超音波 (~ 1 分) 熱を生成し、小胞の形成に支障をきたす。 手順 1.1 1.5 収量小胞の構造の 2 つのタイプを含む懸濁液: 多重層膜ベシクル (MLV) と巨大リポソーム (GUV) (図 1A 1 階)。 ストレージ、脂質懸濁液を 100 μ L 因数、30 マイクロ遠心チューブ用, の合計を使用して分割、-20 ° C で冷凍庫に保存注: 液体窒素で凍結フラッシュ必要はありません保管する前に使用されていません。プロトコルはここで一時停止することができます。4 ° C の冷却装置で脂質懸濁液を残して原因脂質溶解回長期のため、膜組成に影響を与えます。 2. 基板の準備 注: 次のプロトコルは、ISO 14644-1 標準仕様で ISO 8 として分類されるクリーン ルームで行われます。原子層堆積法 (ALD) を使用して、Al2O3基板を作製します。指定されたプロセスのパラメーターは機器依存であり、機器の異なるモデル間で異なる場合があります。彼らはプロセスを開発する最初のパラメーターとして使用できます。 ALD リアクターの温度を 200 ° C に設定します。 一緒にいられる後参照サーフェスとして堆積の厚さを決定するエリプソメトリによるシリコンウエハの試料室にガラス表面 (例えば、ガラス coverslips) をロードします。注: ガラス基板使用アウト-の-、-ボックス、堆積前に溶剤洗浄されませんでした。彼らは、粒子を除去する窒素ガスでフラッシュされてのみ。 400 に、チャンバーを避難 Pa (3 torr) 主反応室にサンプルを転送し、200 に避難しペンシルバニア州注: 原子炉の温度は適切な蒸着 200 ° C で保持されなければなりません。温度変動後堆積を開始する前に、サンプル読み込みを平衡したがってする必要があります。燃焼室圧力は、商工会議所外で広がる任意の前駆物質を避けるために原子炉圧力よりも高くなるように設定されます。 原子膜を堆積を開始します。1 つのサイクルは、1 s パージし、続いて 1 s パージが続く持続時間 200 ms の H2O 露出に続いて、150 ms パルス トリメチル アルミニウム暴露で構成されています。メモ: すべての設定は、商工会議所、原子炉の圧力など、サイクル、およびパージの長さ沈着の定義された速度を達成するために自動化されています。これらのパラメーターは、機器の様々 なモデル間で異なる場合があります。構成済みのレシピ頻繁にベンダーまたはツール クリーン ルームで担当した、単位時間あたりの蒸着膜厚としてユーザーに伝達します。 10 に到達するため、基板上の Al2O3の nm は 100 サイクルのプロセスを繰り返します。サイクル数は、さまざまなレシピや機器間で異なる場合があります成膜速度に依存します。 原子炉からサンプルを削除するには、最初のベント チャンバーの圧力は大気圧に達するまでサンプルを削除します。 使用するまで RT で気密容器にサンプルを格納します。注: 以上のクリーニング使用する前に勧めします。プロトコルはここで一時停止することができます。注: サンプルは、堆積した直後に理想的に使用必要があります。最適なストレージ ・ ポリプロピレン ウェハ キャリア、クリーン ルーム対応のビニール袋、真空封止前に窒素フラッシュされることであるキャリアを包み込み続いて内部サーフェスを配置が必要です。目的は、空中の汚染物質に表面をさらすことを避けるためです。必要に応じて、5 日間の最大 RT で気密容器の表面を保つことができます。長期保存はお勧めできません。このホテルの近隣には、クリーン ルームに簡単にアクセスを持っていないと購入か海外から表面を取得ユーザーのため酸素プラズマやオゾン処理による基板を再酸化が代替ソリューション13あります。 3. 鋼管ネットワークに分子のリン脂質膜の変換 脂質懸濁液を解凍し、きれいなガラス顕微鏡スライド/coverslip の上に懸濁液の 4 μ L 液滴を転送します。 20 分の液滴を脱水します。ドロップレットは、目に見えるである乾燥後、脂質膜が平らな円形に崩壊します。 HEPES 緩衝液の 1 mL と脂質膜を水分補給 (材料の表を参照) で 3 分。注: 復元バッファー量観測室に転送、その後小胞サスペンション (単位体積あたりの小胞の数) の密度に影響します。観察室と必要な小胞密度の量、に応じて水分補給量をチューニングして、0.5-1 mL。いくつかの百マイクロリットルの液滴をサポートする傾向があるきれいなホウケイ酸スライド問題なく 1.5 mL。Coverslip の移動する必要はありません, ので、技術的な問題にこれは導かない。SU 8 ポリマー コーティング スライドより疎水性の表面にも 1.5 mL は堆積した12をすることができます。注: 脂質準備されるべきたて、RT で 20 分以上の水分を補給された脂質の膜の露出はバッファーの蒸発および不完全につながる定義構成以前水分を補給された小胞の部分的な脱水につながると。 観測室の準備: 小胞体変換を開始する必要がある自動ピペットによるバッファー交換を可能にするオープン トップ型観測室が使用されました。この部屋は、寸法 1.5 × 1.5 × 0.5 cm、Al2O3堆積 coverslip の上に付着したポリジメチルシロキサン (PDMS) のフレームで構成されます。マウントされた観測室の方式は図 1Gで表されます。次の手順は、PDMS フレームを作製し、観察室を組み立てる実行されました。 100 ml の氷浴でビーカーのイソプロパノールの島の 100 g を混ぜて KOH 溶液を準備します。マグネチックスターラーと電磁攪拌プレートを使用して、島を完全に溶解するまで 10 h 以上をかき混ぜます。注意: KOH 溶液は腐食性、皮膚のやけど、適切な個人用保護具を扱うため、常につながることができます。注: 島のイソプロパノールで溶解度は水のように、高くないです。分解は発熱です。溶解し、連続的に攪拌前に KOH ペレットを破砕することをお勧めします。 ガラス シャーレを水没 (d = 6 cm) それが一晩で RT し KOH 溶液に。 次の日、ガラス皿をソリューションから削除、5 分の脱イオン水を容器に浸し、水で数回すすぎ、簡単にその部分を確保するための窒素の流れと表面 1 h. 打撃 80 ° C で乾燥炉内配置icles が削除されます。 表面のパッシベーションし PDMS への接着を防ぐため、重み付けボートなどきれいなプラスチック容器にプラスチック注射器で dimethyldichlorosilane の 200 μ L を転送します。 (低真空、~ 20 kPa) 真空デシケータにガラス 1 h のシランと一緒にシャーレを格納します。注意: Dimethyldichlorosilane は毒性と関連付けられた個人保護具のヒューム フードの下で常に処理する必要があります。 残り dimethyldichlorosilane 蒸気を逃がすためにシャーレを収集する前に 15 分を待機します。ペトリ皿は、シラン処理、表面が疎水性。注: この手順の成功をテストする簡単な方法は、シラン処理シャーレの上に水滴を置くことです。表面の液滴の接触角は、未処理ガラスと比較して目に見えて増やす必要があります。 250 mL のプラスチック容器 (パッケージから新鮮な透明プラスチック カップ)、シリコーンのエラストマー硬化剤 (10:1) の 1 g とシリコーン ・ エラストマーの基本の 10 g をミックスします。5 分樹脂攪拌機/プラスチックのヘラを使って混ぜます。注: 空気の泡は攪拌しながら、時に形成され、PDMS は淡い白になります。 < 20 kpa までの範囲でドガのすべての拡大気泡が崩壊するまで混合物を脱水する (高真空は、プロセスを加速する)。シラン処理ペトリ皿に脱の混合物を注ぐ。 オーブンで 2 時間 65 ° C で治します。注: > 95 ° C に温度を上げることによって硬化速度を 2 倍にすることは硬化温度の上昇は材料の剛性の増加の結果します。 RT に硬化 PDMS でいっぱいペトリ皿を冷却し、ヘラで PDMS スラブを削除します。 メスと、顕微鏡ステージの利用可能な開口部の適切な寸法と幾何学にフレームをカットしています。1.5 (長さ) × 1.5 (幅) × 0.5 (高さ) cm のサイズは、ほとんどの設定に適しています。 滑らかな側面 (ペトリ皿と接触していた底側) をもたらす、PDMS のフレーム表面のアクティブ側と接触する Al2O3フィルムが存在してフレームをプッシュするとお互いに対して表面軽く押さえる付着します。注: PDMS フレームと Al2O3基板との密着性は弱いです。接触インタ フェースで空気泡の存在は、デ-添付ファイルと、その結果、バッファーおよび関連する内容の漏洩を引き起こす可能性があります。PDMS フレームは、それぞれ直前に使用、イソプロパノールをすすいだの DI 水ですすぎ、窒素で毎朝のブローや続く場合数回使用できます。ペトリ皿シラン処理を再利用もできます。 Ca2 +-HEPES 緩衝液と観測室を埋める (材料の表を参照してください)。注: サーフェスをパッケージを開封後すぐに使用する必要があります。空気との接触は、徐々 に表面の活性を低下させる、汚染物質の吸着につながります。商工会議所は、組立後すぐにバッファーで満たされる必要があります。後続の手順で水分を補給された脂質の追加できるように、全体の室容積を記入しないでください。 共焦点顕微鏡ステージ上に商工会議所を配置します。今懸濁液パスツール ピペット (図 1A-1 グラム) のプラスチックで商工会議所に巨大な小胞を含む水分を補給された脂質素材を転送します。 基板上に付着し、表面 (図 1H 1 j) に広がる小胞に 10-20 分を待ちます。注: の広がり表面の脂質の沈着の直後後から開始します。拡散の速度可能性がありますにより若干異なります脂質組成、Al2O3蒸着法(ADL、RF スパッタリング法、化学気相蒸着等)、基板、および二価の陽イオン濃度の新鮮さ、バッファー。14パッチ広がりの破裂前にバッファー交換が実行されることを確認します。 観察した後、底に薄いバッファー フィルムのみが残るよう複数の脂質スプレッドは自動ピペットを介して周囲のバッファーをゆっくり取り外します。注: バッファーの迅速な除去は、表面の脂質構造を摂動します。 ゆっくりと観測室のキレート剤 HEPES 緩衝液を充填して周囲のバッファー交換に進みます (材料表参照) 自動ピペット (図 1K) を使用します。注: バッファーの追加により急激な表面の脂質構造を摂動します。 この最後のステップは、動的なナノチューブ ネットワーク、キレート剤によるピン止めのはずれ、MLV4 (図 1L 1 年) に DLBM の取り消しの結果として形成を得られます。 4. 顕微鏡観察 595 テキサス赤 DHPE を励起する白色レーザー ソース逆レーザー顕微鏡共焦点走査周波数は 400 hz 採用 (1.3 NA) の油浸対物レンズ × 40 を使用して画像を取得 nm。700 605 から排出量を収集ハイブリッド光子検出器を用いた nm。注: また、エピ蛍光顕微鏡使用できますイメージングのため。使用可能な光源によって適切な脂質色素共役を選択します。