Indução de lesão de pulmão de camundongo por injeção endotraqueal de bleomicina
Summary
Aqui nós apresentamos um método eficaz para investigar a atividade antifibróticos de pilhas stromal mesenquimais humanas infundidas intravenosamente obtidas do cabo de cordão umbilical inteiro que segue a indução de ferimento de pulmão por uma injeção endotraqueal da bleomicina em C57Bl /6 ratos. Este protocolo pode facilmente ser estendido ao teste pré-clínico de outras terapêuticas.
Abstract
A fibrose pulmonar é uma marca registrada de várias doenças pulmonares humanas com uma etiologia diferente. Como as terapias atuais são bastante limitadas, os modelos de mouse continuam a ser uma ferramenta essencial para o desenvolvimento de novas estratégias antifibróticas. Aqui nós fornecemos um método eficaz para investigar in vivo a atividade antifibróticos de pilhas stromal mesenquimais humanas obtidas do cabo de cordão umbilical inteiro (HUC-msc) em atenuar ferimento Bleomycin-induzido do pulmão. C57BL/6 camundongos recebem uma única injeção endotraqueal de bleomicina (1,5 U/kg de peso corporal) seguida por uma dupla infusão de hUC-MSC (2,5 x 105) na veia cauda, 24 h e 7 dias após a administração de bleomicina. Em cima do sacrifício nos dias 8, 14, ou 21, as mudanças inflamatórios e fibrótica, o índice do colagénio, e a presença de HUC-msc no tecido de pulmão explantados são analisadas. A injeção de bleomicina na traqueia do camundongo permite a segmentação direta dos pulmões, levando a uma extensa inflamação pulmonar e fibrose. A administração sistemática de uma dose dobro de HUC-MSC conduz ao embotamento adiantado da lesão de pulmão Bleomycin-induzida. Intravenosamente infundido hUC-MSC são transientemente enenxertados nos pulmões do rato, onde exercem a sua atividade anti-inflamatória e antifibrótica. Em conclusão, este protocolo foi aplicado com sucesso para o teste pré-clínico de hUC-MSC em um modelo experimental do rato da fibrose pulmonaa humana. No entanto, essa técnica pode ser facilmente estendida tanto para estudar o efeito de diferentes substâncias endotraquemalmente administradas na fisiopatologia dos pulmões quanto para validar novas terapias sistêmicas anti-inflamatórias e antifibróticas.
Introduction
A fibrose pulmonar é um processo patológico progressivo caracterizado pela deposição excessiva de componentes da matriz extracelular, principalmente colágeno tipo I, no interstício pulmonar, levando a comprometimento da função pulmonar. É a indicação de diversas doenças de pulmão humanas com uma etiologia diferente e representa um fator prognóstico clínico pobre. Desde que as terapias atuais são rather limitadas1, os modelos do rato continuam a ser uma ferramenta essencial para a investigação mais adicional dos mecanismos patogénicos que influenciam o início e a progressão da doença e para desenvolver o antifibróticos novo estratégias2,3.
Até o momento, a administração de bleomicina tem sido o modelo mais comumente aplicado de fibrose pulmonar induzida experimentalmente4. Ao lado de múltiplos métodos de entrega (incluindo intravenoso, intraperitoneal, subcutâneo e inalatório), injeções intratraqueal ou endotraqueal de bleomicina emergiram como as rotas mais freqüentemente utilizadas4,5. O método que descrevemos neste documento foi desenvolvido para evitar o efeito escaldamento da bleomicina na mucosa traqueal. De fato, exteriorizando a traquéia e visualizando-o através de um microscópio de operação, é possível alcançar a instilação de todo o volume de solução de bleomicina diretamente na via aérea inferior, sem derrames nas vias aéreas superiores. Quando a perícia cirúrgica exigida e a instrumentação estão disponíveis, este método permite a indução segura, robusta, e reprodutível da inflamação e da fibrose do pulmão, como relatado abaixo.
Protocol
Representative Results
Discussion
A administração endotraqueal é a via preferencial para a entrega de agentes exógenos nos pulmões. Desde há vários anos, a injeção direta de bleomicina na traquéia tem sido amplamente utilizada para induzir a fibrose pulmonar13 e, recentemente, técnicas mais avançadas e não invasivas têm sido desenvolvidas para realizar esta14,15 ,16.
O método descrito aqui forne…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por uma subvenção RF-2011-02352331 de Ministero italiano della Salute (para Armando Gabrielli).
Materials
| C57BL/6 mice | Charles River | Jax Mice Stock n. 000664 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Barraquer Micro Needle Holder | Lawton | 62-3755 | |
| Bleomycin sulfate | Sigma-Aldrich | B1141000 | |
| Bürker chamber | Brand | 718905 | |
| Culture Flasks | EuroClone | ET7076 | |
| Disposable razors | Unigloves | 4080 | |
| Dissecting Forceps | Aesculap Surgical Instruments | BD311R | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Heating pad | 2Biological Instruments | 557023 | |
| Isoflurane Vet | Merial Italia | N01AB06 | |
| Operating Microscope | Carl Zeiss | Model OPM 16 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | 12563-029 | |
| Vannas Micro Scissors | Aesculap Surgical Instruments | OC498R | |
| Vicryl Plus 4/0 Absorbable Suture, FS-2 needle 19 mm | Ethicon | VCP392ZH |
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