Induzione di lesioni polmonari del topo da Iniezione endotracheale di Bleomycin
Summary
Qui presentiamo un metodo efficace per studiare l’attività antifibrotica delle cellule manomalifonde umane infuso infuso ottenuto da tutto il cordone ombelicale in seguito all’induzione della lesione polmonare da un’iniezione endotracheale di bleomycina nel C57BL /6 topi. Questo protocollo può essere facilmente esteso ai test preclinici di altre terapie.
Abstract
La fibrosi polmonare è un segno distintivo di diverse malattie polmonari umane con un’eziologia diversa. Poiché le terapie attuali sono piuttosto limitate, i modelli murini continuano ad essere uno strumento essenziale per lo sviluppo di nuove strategie antifibrotiche. Qui forniamo un metodo efficace per studiare l’attività antifibrotica in vivo delle cellule stromali mesenchymale umane ottenute da intero cordone ombelicale (hUC-MSC) nell’attenuazione della lesione polmonare indotta dalla bleomicina. I topi C57BL/6 ricevono una singola iniezione endotracheale di bleomycin (1,5 U/kg di peso corporeo) seguita da una doppia infusione di hUC-MSC (2,5 x 105)nella vena posteriore, 24 h e 7 giorni dopo la somministrazione della bleomycina. Al sacrificio ai giorni 8, 14, o 21, vengono analizzati i cambiamenti infiammatori e fibrotici, il contenuto di collagene e la presenza di hUC-MSC nel tessuto polmonare espiantato. L’iniezione di bleomycin nella trachea del topo consente il targeting diretto dei polmoni, portando a un’estesa infiammazione polmonare e fibrosi. La somministrazione sistemica di una doppia dose di hUC-MSC provoca la rapida smussatura della lesione polmonare indotta dalla bleomicina. Intravenosamente infuso hUC-MSC sono transitoriamente intrisi nei polmoni di topo, dove esercitano la loro attività antinfiammatoria e antifibrotica. In conclusione, questo protocollo è stato applicato con successo per il test preclinico di hUC-MSC in un modello murino sperimentale di fibrosi polmonare umana. Tuttavia, questa tecnica può essere facilmente estesa sia per studiare l’effetto di diverse sostanze somministrate endotrachealmente sulla patofisiologia dei polmoni sia per convalidare nuove terapie sistemiche antinfiammatorie e antifibrotiche.
Introduction
La fibrosi polmonare è un processo patologico progressivo caratterizzato dall’eccessiva deposizione di componenti della matrice extracellulare, principalmente collagene di tipo I, nell’interstizio polmonare, che porta a una funzione polmonare compromessa. È il segno distintivo di diverse malattie polmonari umane con un’eziologia diversa e rappresenta un fattore prognostico clinico povero. Poiché le terapie attuali sono piuttosto limitate di1, i modelli murini continuano ad essere uno strumento essenziale sia per l’ulteriore indagine dei meccanismi patogeni che influenzano l’insorgenza e la progressione della malattia, sia per sviluppare nuovi antifibrotici strategie2,3.
Ad oggi, la somministrazione di bleomycin è stato il modello più comunemente applicato di fibrosi polmonare indotta sperimentalmente4. Accanto a più metodi di fornitura (tra cui per via endovenosa, intraperitoneale, sottocutanea e inalazionale), le iniezioni intratracheali o endotracheali di bleomycin sono emerse come le rotte più utilizzate4,5. Il metodo che descriviamo qui è stato sviluppato per evitare l’effetto scottante della bleomycin sulla mucosa tracheale. L’esterno della trachea e la visualizzazione attraverso un microscopio operativo, infatti, è possibile ottenere l’instillazione dell’intero volume della soluzione di bleomycina direttamente nelle vie aeree inferiori senza fuoriuscite nelle vie aeree superiori. Quando sono disponibili le competenze chirurgiche e la strumentazione richieste, questo metodo consente l’induzione sicura, robusta e riproducibile dell’infiammazione polmonare e della fibrosi, come riportato di seguito.
Protocol
Representative Results
Discussion
La somministrazione endotrale è la via preferenziale per la consegna di agenti esogeni nei polmoni. Da diversi anni, l’iniezione diretta di bleomycin nella trachea è stata ampiamente utilizzata per indurre la fibrosi polmonare13 e, recentemente, sono state sviluppate tecniche non invasive più avanzate per realizzare questo14,15 ,16.
Il metodo descritto di seguito offre dive…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione RF-2011-02352331 da Italiano Della Salute (a Armatondo Gabrielli).
Materials
| C57BL/6 mice | Charles River | Jax Mice Stock n. 000664 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Barraquer Micro Needle Holder | Lawton | 62-3755 | |
| Bleomycin sulfate | Sigma-Aldrich | B1141000 | |
| Bürker chamber | Brand | 718905 | |
| Culture Flasks | EuroClone | ET7076 | |
| Disposable razors | Unigloves | 4080 | |
| Dissecting Forceps | Aesculap Surgical Instruments | BD311R | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Heating pad | 2Biological Instruments | 557023 | |
| Isoflurane Vet | Merial Italia | N01AB06 | |
| Operating Microscope | Carl Zeiss | Model OPM 16 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | 12563-029 | |
| Vannas Micro Scissors | Aesculap Surgical Instruments | OC498R | |
| Vicryl Plus 4/0 Absorbable Suture, FS-2 needle 19 mm | Ethicon | VCP392ZH |
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