Inductie van muis long letsel door Endotracheale injectie van bleomycine
Summary
Hier presenteren we een effectieve methode voor het onderzoeken van de antifibrotische activiteit van intraveneus geïnfundeerde humane mesenchymale stromale cellen verkregen uit de gehele navelstreng na de inductie van long letsel door een Endotracheale injectie van bleomycine in C57BL /6 muizen. Dit protocol kan eenvoudig worden uitgebreid tot de preklinische testen van andere therapieën.
Abstract
Pulmonale fibrose is een kenmerk van verschillende menselijke longziekten met een verschillende etiologie. Aangezien de huidige therapieën vrij beperkt zijn, blijven Muismodellen een essentieel hulpmiddel voor het ontwikkelen van nieuwe antifibrotische strategieën. Hier bieden we een effectieve methode om te onderzoeken in vivo antifibrotische activiteit van menselijke mesenchymale stromale cellen verkregen uit gehele navelstreng (Huc-msc) in verzwakkende bleomycine-geïnduceerde long letsel. C57BL/6 muizen krijgen een enkelvoudige Endotracheale injectie met bleomycine (1,5 U/kg lichaamsgewicht) gevolgd door een dubbele infusie met hUC-MSC (2,5 x 105) in de staart ader, 24 uur en 7 dagen na de toediening van bleomycine. Na opoffering op dag 8, 14 of 21 worden inflammatoire en fibrotische veranderingen, collageengehalte en hUC-MSC aanwezigheid in explanted longweefsel geanalyseerd. De injectie van bleomycine in de luchtpijp van de muis maakt de directe targeting van de longen mogelijk, wat leidt tot uitgebreide pulmonale ontsteking en fibrose. De systemische toediening van een dubbele dosis van hUC-MSC resulteert in de vroege afstomting van de bleomycine-geïnduceerde long letsel. Intraveneus geïnfundeerd hUC-MSC worden transiënt in de muis longen, waar ze hun ontstekingsremmende en antifibrotische activiteit uitoefenen. Tot slot, dit protocol is met succes toegepast voor de preklinische testen van hUC-MSC in een experimenteel muismodel van menselijke pulmonale fibrose. Deze techniek kan echter gemakkelijk worden uitgebreid, zowel om het effect van verschillende endotracheally toegediende stoffen op de pathofysiologie van de longen te bestuderen als om nieuwe ontstekingsremmende en antifibrotische systemische therapieën te valideren.
Introduction
Pulmonale fibrose is een progressief pathologisch proces dat wordt gekenmerkt door de overmatige depositie van extracellulaire matrix componenten, voornamelijk type I collageen, in het Long interstitium, wat leidt tot een verminderde longfunctie. Het is het kenmerk van verschillende menselijke longziekten met een verschillende etiologie en vertegenwoordigt een slechte klinische prognostische factor. Aangezien de huidige therapieën vrij beperkt zijn1, Muismodellen blijven een essentieel instrument zowel voor het verdere onderzoek van de pathogene mechanismen beïnvloeden het ontstaan en de progressie van de ziekte en voor de ontwikkeling van nieuwe antifibrotische strategieën2,3.
Tot op heden is de toediening van bleomycine het meest toegepaste model van experimenteel geïnduceerde pulmonale fibrose4. Naast meerdere methoden (waaronder intraveneuze, intraperitoneale, subcutane en inhalationele), zijn intratracheale of Endotracheale injecties van bleomycine ontstaan als de meest gebruikte routes4,5. De methode die we hierin beschrijven is ontwikkeld om het scalaire effect van bleomycine op het tracheale slijmvlies te voorkomen. In feite is het door het exterioriseren van de luchtpijp en het visualiseren ervan door middel van een operatiemicroscoop het mogelijk om de indrukking van het gehele volume bleomycine oplossing rechtstreeks in de lagere luchtweg te bereiken zonder morsen in de bovenste luchtweg. Wanneer de vereiste chirurgische expertise en instrumentatie beschikbaar zijn, zorgt deze methode voor de veilige, robuuste en reproduceerbare inductie van longontsteking en fibrose, zoals hieronder gerapporteerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Endotracheale toediening is de voorkeursroute voor het leveren van exogene agentia in de longen. Sinds enkele jaren is de directe injectie van bleomycine in de luchtpijp op grote schaal gebruikt voor het opwekken van pulmonale fibrose13 en recentelijk zijn er geavanceerdere, niet-invasieve technieken ontwikkeld om deze14,15 ,16.
De hier beschreven methode biedt verschillende z…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door een subsidie RF-2011-02352331 van Ministero Italiano della Salute (aan Armando Gabrielli).
Materials
| C57BL/6 mice | Charles River | Jax Mice Stock n. 000664 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Barraquer Micro Needle Holder | Lawton | 62-3755 | |
| Bleomycin sulfate | Sigma-Aldrich | B1141000 | |
| Bürker chamber | Brand | 718905 | |
| Culture Flasks | EuroClone | ET7076 | |
| Disposable razors | Unigloves | 4080 | |
| Dissecting Forceps | Aesculap Surgical Instruments | BD311R | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Heating pad | 2Biological Instruments | 557023 | |
| Isoflurane Vet | Merial Italia | N01AB06 | |
| Operating Microscope | Carl Zeiss | Model OPM 16 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | 12563-029 | |
| Vannas Micro Scissors | Aesculap Surgical Instruments | OC498R | |
| Vicryl Plus 4/0 Absorbable Suture, FS-2 needle 19 mm | Ethicon | VCP392ZH |
References
- Iudici, M., et al. Where are we going in the management of interstitial lung disease in patients with systemic sclerosis?. Autoimmunity Reviews. 14 (7), 575-578 (2015).
- Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 294 (2), L152-L160 (2008).
- Mouratis, M. A., Aidinis, V. Modeling pulmonary fibrosis with bleomycin. Current Opinion in Pulmonary Medicine. 17 (5), 355-361 (2011).
- Moeller, A., Ask, K., Warburton, D., Gauldie, J., Kolb, M. The bleomycin animal model: a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis?. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 40 (3), 362-382 (2008).
- Moore, B. B., et al. Animal models of fibrotic lung disease. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 167-179 (2013).
- Schrier, D. J., Kunkel, R. G., Phan, S. H. The role of strain variation in murine bleomycin-induced pulmonary fibrosis. American Review of Respiratory Disease. 127 (1), 63-66 (1983).
- Phan, S. H., Kunkel, S. L. Lung cytokine production in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Experimental Lung Research. 18 (1), 29-43 (1992).
- Capelli, C., et al. Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate. Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).
- Beeravolu, N., et al. Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta. Journal of Visualized Experiments. (122), e55224 (2017).
- Moroncini, G., et al. Mesenchymal stromal cells from human umbilical cord prevent the development of lung fibrosis in immunocompetent mice. PLoS One. 13 (6), e0196048 (2018).
- Shahzeidi, S., Jeffery, P. K., Laurent, G. J., McAnulty, R. J. Increased type I procollagen mRNA transcripts in the lungs of mice during the development of bleomycin-induced fibrosis. European Respiratory Journal. 7 (11), 1938-1943 (1994).
- Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
- Scotton, C. J., Chambers, R. C. Bleomycin revisited: towards a more representative model of IPF?. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (4), L439-L441 (2010).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
- Thomas, J. L., et al. Endotracheal intubation in mice via direct laryngoscopy using an otoscope. Journal of Visualized Experiments. (86), e50269 (2014).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
- Dutta, S., Sengupta, P. Men and mice: Relating their ages. Life Sciences. 152, 244-248 (2016).
- Sueblinvong, V., et al. Predisposition for disrepair in the aged lung. American Journal of Medical Sciences. 344 (1), 41-51 (2012).
- Moodley, Y., et al. Human umbilical cord mesenchymal stem cells reduce fibrosis of bleomycin-induced lung injury. American Journal of Pathology. 175 (1), 303-313 (2009).
- How, C. K., et al. Induced pluripotent stem cells mediate the release of interferon gamma-induced protein 10 and alleviate bleomycin-induced lung inflammation and fibrosis. Shock. 39 (3), 261-270 (2013).
- Lee, R. H., et al. TSG-6 as a biomarker to predict efficacy of human mesenchymal stem/progenitor cells (hMSCs) in modulating sterile inflammation in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (47), 16766-16771 (2014).
